| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-13页 |
| 第1章 绪论 | 第13-24页 |
| ·选题意义 | 第13-14页 |
| ·糖化酶 | 第14-19页 |
| ·糖化酶的来源及性质 | 第14-16页 |
| ·糖化酶的酶活检测 | 第16页 |
| ·糖化酶的生产方式 | 第16-17页 |
| ·黑曲霉糖化酶基因的研究进展 | 第17-19页 |
| ·毕赤酵母表达体系的研究 | 第19-21页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第19-20页 |
| ·毕赤酵母表达系统的类型 | 第20页 |
| ·影响毕赤酵母中外源蛋白表达水平的主要因素 | 第20-21页 |
| ·毕赤酵母表达系统重组蛋白的方法 | 第21页 |
| ·酿酒酵母表达体系 | 第21-23页 |
| ·酿酒酵母 | 第21-22页 |
| ·酿酒酵母系统的分类 | 第22-23页 |
| ·本研究的目的和内容 | 第23-24页 |
| ·研究目的 | 第23页 |
| ·研究内容 | 第23-24页 |
| 第2章 黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母的克隆表达 | 第24-53页 |
| ·实验材料 | 第24-27页 |
| ·菌种及载体 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·主要试剂 | 第25-26页 |
| ·器材与仪器 | 第26-27页 |
| ·实验方法 | 第27-40页 |
| ·菌丝体预处理 | 第27页 |
| ·总RNA提取 | 第27页 |
| ·mRNA提取 | 第27-28页 |
| ·cDNA双链全长合成 | 第28-30页 |
| ·接头连接 | 第30页 |
| ·Not Ⅰ酶切 | 第30页 |
| ·去除短链cDNA | 第30-32页 |
| ·pPIC9K原核宿主菌的培养及质粒pPIC9K提取 | 第32页 |
| ·质粒EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切 | 第32-33页 |
| ·表达质粒pPIC9K-cDNA的构建 | 第33页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态制备 | 第33-34页 |
| ·毕赤酵母GS115转化 | 第34-35页 |
| ·阳性克隆的筛选及测序分析 | 第35-37页 |
| ·发酵性能的测定 | 第37-38页 |
| ·用甲醇诱导重组毕赤酵母发酵产酶 | 第37-38页 |
| ·重组表达酶的性质分析 | 第38页 |
| ·发酵液纯化及SDS-PAGE | 第38-40页 |
| ·实验结果 | 第40-51页 |
| ·黑曲霉总mRNA的提取 | 第40-41页 |
| ·pPI9K质粒的提取结果 | 第41-42页 |
| ·阳性克隆PCR | 第42页 |
| ·测序及序列分析 | 第42-44页 |
| ·重组毕赤酵母糖化酶酶活测定 | 第44-46页 |
| ·重组毕赤酵母糖化酶酶性质的研究 | 第46-47页 |
| ·金属离子对重组毕赤酵母糖化酶酶活的研究 | 第47-50页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析重组毕赤酵母分泌表达糖化酶 | 第50-51页 |
| ·结论 | 第51-53页 |
| ·实验小结 | 第51页 |
| ·实验讨论 | 第51-53页 |
| 第3章 黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母的克隆表达 | 第53-71页 |
| ·实验材料 | 第53-56页 |
| ·菌种 | 第53-54页 |
| ·培养基 | 第54-55页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第55-56页 |
| ·主要试剂 | 第55页 |
| ·主要仪器 | 第55-56页 |
| ·试验方法 | 第56-62页 |
| ·质粒pYES2的提取 | 第56页 |
| ·菌丝体预处理 | 第56页 |
| ·总RNA提取 | 第56页 |
| ·mRNA提取 | 第56页 |
| ·cDNA方法的合成 | 第56页 |
| ·质粒双酶切 | 第56-57页 |
| ·表达质粒pYES2-cDNA的构建 | 第57页 |
| ·酿酒酵母INVScl感受态制备及电转化 | 第57-58页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第58-59页 |
| ·挑选的阳性克隆质粒的抽提 | 第58-59页 |
| ·EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切验证 | 第59页 |
| ·双酶切后的质DNA的纯化 | 第59页 |
| ·目的片段的纯化 | 第59页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第59页 |
| ·载体连接 | 第59页 |
| ·转化 | 第59页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第59-60页 |
| ·测序 | 第60页 |
| ·糖化酶酶活检测 | 第60-61页 |
| ·重组毕赤酵母糖化酶酶学的性质分析 | 第61页 |
| ·发酵液中酒精含量的测定 | 第61-62页 |
| ·纯化和SDS-PAGE电泳 | 第62页 |
| ·实验结果 | 第62-70页 |
| ·pYES2质粒的提取 | 第62页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第62-63页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第63-64页 |
| ·测序及序列分析 | 第64页 |
| ·重组酿酒酵母糖化酶酶活 | 第64-67页 |
| ·葡萄糖标准曲线 | 第65页 |
| ·重组酿酒酵母糖化酶酶学性质的研究 | 第65-67页 |
| ·重组酿酒酵母酒精发酵能力的测定 | 第67-68页 |
| ·酒精标准曲线的测定 | 第67页 |
| ·重组酿酒酵母酒精发酵能力的测定 | 第67-68页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第68-69页 |
| ·重组质粒在酿酒酵母工程菌中的稳定性 | 第69-70页 |
| ·实验小结 | 第70-71页 |
| ·实验结论 | 第70页 |
| ·实验讨论 | 第70-71页 |
| 第4章 结论与展望 | 第71-73页 |
| ·实验结论 | 第71页 |
| ·展望 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |