| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-13页 |
| 第1章 引言 | 第13-23页 |
| ·HCV简介 | 第13-16页 |
| ·HCV的影响 | 第13-14页 |
| ·HCV的生活史及其结构 | 第14-15页 |
| ·HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的特点 | 第15-16页 |
| ·抗HCV治疗的现状 | 第16页 |
| ·NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂研究的现状 | 第16-18页 |
| ·目前用于NS3/4A蛋白酶抑制剂筛选的方法 | 第16-17页 |
| ·NS3/4A蛋白酶抑制剂的细胞筛选模型研究现状 | 第17-18页 |
| ·选择的报告基因 | 第18-20页 |
| ·GFP内部特殊的外源序列插入位点 | 第18-19页 |
| ·报告基因的改造 | 第19-20页 |
| ·本课题的实验意义、目的和研究思路 | 第20-23页 |
| ·实验意义和目的 | 第20页 |
| ·研究思路 | 第20-21页 |
| ·实验设计 | 第21-23页 |
| 第2章 实验材料和方法 | 第23-37页 |
| ·实验材料 | 第23-26页 |
| ·菌种和载体 | 第23页 |
| ·细胞系和细胞培养基 | 第23页 |
| ·工具酶,试剂(盒) | 第23-24页 |
| ·试剂的配制 | 第24-26页 |
| ·实验仪器 | 第26-27页 |
| ·实验方法 | 第27-37页 |
| ·提取质粒DNA | 第27-28页 |
| ·载体质粒的双酶切处理 | 第28页 |
| ·切胶回收DNA | 第28-29页 |
| ·普通PCR反应的体系和条件 | 第29页 |
| ·重叠PCR反应的体系及条件 | 第29-30页 |
| ·DNA片段双酶切的处理 | 第30页 |
| ·纯化PCR产物及酶切产物 | 第30页 |
| ·连接反应 | 第30-31页 |
| ·质粒DNA转化到感受态细胞 | 第31页 |
| ·菌落PCR法鉴定阳性克隆 | 第31页 |
| ·制备感受态细胞 | 第31-32页 |
| ·共转化的最终实现 | 第32页 |
| ·诱导蛋白质的表达 | 第32页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第32-33页 |
| ·制片观察 | 第33页 |
| ·细胞消化与传代 | 第33-34页 |
| ·细胞计数 | 第34页 |
| ·转染观察 | 第34页 |
| ·裂解 | 第34-35页 |
| ·western-blot实验步骤 | 第35-37页 |
| 第3章 真核载体中报告分子的构建 | 第37-45页 |
| ·EGFP-5AB部分 | 第37-41页 |
| ·实验材料 | 第38页 |
| ·方法和结果 | 第38-41页 |
| ·EGFP-5AB-2A部分 | 第41-44页 |
| ·实验材料 | 第41-42页 |
| ·方法和结果 | 第42-44页 |
| ·小结 | 第44-45页 |
| 第4章 报告分子及宿主细胞的选择 | 第45-51页 |
| ·实验材料 | 第45页 |
| ·菌种和载体 | 第45页 |
| ·细胞系和细胞培养基 | 第45页 |
| ·方法和结果 | 第45-50页 |
| ·报告分子的转染及荧光检测 | 第45-47页 |
| ·宿主细胞的选择 | 第47-48页 |
| ·优化细胞转染的条件 | 第48-50页 |
| ·分析和讨论 | 第50页 |
| ·小结 | 第50-51页 |
| 第5章 原核宿主中报告分子与NS3/4A的表达检测 | 第51-60页 |
| ·实验材料 | 第51页 |
| ·菌种和载体 | 第51页 |
| ·工具酶,试剂(盒) | 第51页 |
| ·方法和结果 | 第51-58页 |
| ·重组质粒pET-28a-EGFP的构建 | 第51-53页 |
| ·制备感受态细胞,实现共转化 | 第53-54页 |
| ·观察荧光表达结果 | 第54-55页 |
| ·NS3/4A表达对菌体形态的影响 | 第55-56页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第56-58页 |
| ·分析和讨论 | 第58页 |
| ·小结 | 第58-60页 |
| 第6章 构建目的筛选分子并优化获得目的筛选系统 | 第60-72页 |
| ·实验材料 | 第60页 |
| ·菌种和载体 | 第60页 |
| ·工具酶,试剂(盒) | 第60页 |
| ·细胞系和细胞培养基 | 第60页 |
| ·方法和结果 | 第60-71页 |
| ·重组质粒pcDNA3.1-E173_(5AB)-2A-NS3/4A的构建 | 第60-62页 |
| ·重组质粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A表达质粒的构建 | 第62-63页 |
| ·转染后观察绿色荧光的表达情况 | 第63-65页 |
| ·E173_(5AB)-2A-NS3/4A的蛋白免疫印迹检测 | 第65页 |
| ·重组质粒pIRES-E173_(5AB)-(IRES)-NS3/4A及对照质粒的构建 | 第65-69页 |
| ·转染后观察绿色荧光表达情况 | 第69-70页 |
| ·筛选系统表达蛋白的免疫印迹检测 | 第70-71页 |
| ·分析和讨论 | 第71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 第7章 总结 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-77页 |
| 附录 | 第77-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第81页 |
