葡萄糖氧化酶的体外定向进化
| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-9页 |
| 第一章 引言 | 第9-22页 |
| 1 黑曲霉葡萄糖氧化酶结构与功能研究 | 第9-15页 |
| ·概述 | 第9页 |
| ·黑曲霉葡萄糖氧化酶结构及活性中心的构成 | 第9-11页 |
| ·黑曲霉葡萄糖氧化酶的催化机理及反应机理 | 第11-14页 |
| ·葡萄糖氧化酶的应用 | 第14页 |
| ·结束语 | 第14-15页 |
| 2 蛋白质定向进化的研究进展 | 第15-22页 |
| ·概述 | 第15页 |
| ·随机突变库的建立方法 | 第15-17页 |
| ·突变库的高通量筛选 | 第17-20页 |
| ·小结 | 第20-22页 |
| 第二章 葡萄糖氧化酶体外定向进化 | 第22-46页 |
| 1 材料与方法 | 第23-32页 |
| ·材料 | 第23-27页 |
| ·菌株与质粒 | 第23-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·试剂与材料 | 第25-27页 |
| ·实验方法 | 第27-32页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第27页 |
| ·error-prone PCR扩增GOD基因 | 第27-28页 |
| ·突变文库的构建 | 第28-29页 |
| ·含有突变基因的质粒文库的构建 | 第28页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第28页 |
| ·转化 | 第28页 |
| ·含有突变基因的 DNA的收集 | 第28页 |
| ·酵母的电转化和基因组的提取 | 第28-29页 |
| ·文库的筛选 | 第29页 |
| ·GOD定点突变体表达载体的构建 | 第29-30页 |
| ·蛋白质的诱导生成 | 第30页 |
| ·GOD活力的测定 | 第30页 |
| ·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第30页 |
| ·蛋白质的纯化 | 第30-31页 |
| ·蛋白质的浓度测定 | 第31页 |
| ·GOD动力学的测定 | 第31-32页 |
| ·GOD其他酶学性质的测定 | 第32页 |
| 2 结果 | 第32-44页 |
| ·pPIC9kGOD的构建 | 第32-33页 |
| ·质粒的酶切鉴定 | 第33页 |
| ·GOD在甲基酵母中的表达 | 第33-34页 |
| ·GOD的纯化 | 第34-35页 |
| ·突变文库的筛选 | 第35-39页 |
| ·GOD的酶学性质分析 | 第39-42页 |
| ·酶比活及动力学性质分析 | 第39-40页 |
| ·突变株的热稳定性和储存稳定性分析 | 第40-42页 |
| ·定点突变克隆的构建及分析 | 第42-44页 |
| 3 讨论 | 第44-46页 |
| ·文库的建立与筛选 | 第44页 |
| ·突变株酶活提高的可能原因 | 第44-46页 |
| 第三章 结论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-50页 |
| 待发表文章目录 | 第50-51页 |
| 致谢 | 第51页 |
