| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-11页 |
| 本论文缩略词表 | 第11-18页 |
| 第一章 前言 | 第18-49页 |
| 第一节 植物钙信号转导系统 | 第18-29页 |
| 1 植物细胞信号转导 | 第18页 |
| 2 蛋白激酶与植物信号转导 | 第18-20页 |
| ·蛋白质的磷酸化与信号转导 | 第18-19页 |
| ·蛋白激酶的分类 | 第19-20页 |
| ·植物体内的蛋白激酶利信号转导 | 第20页 |
| 3 钙信号系统 | 第20-29页 |
| ·钙 | 第21-23页 |
| ·钙调素 | 第23-29页 |
| ·钙调素基本结构 | 第24-25页 |
| ·植物钙调素的调控模式和功能 | 第25-29页 |
| 第二节 植物钙相关的蛋白激酶 | 第29-37页 |
| 1 钙依赖性蛋白激酶和其相关的蛋白激酶 | 第29-31页 |
| 2 植物中钙调素结合蛋白 | 第31-37页 |
| ·嵌合型钙／钙调素依赖型蛋白激酶 | 第34-35页 |
| ·植物钙调素结合蛋白激酶 | 第35-37页 |
| 第三节 植物开花调控 | 第37-48页 |
| 1 光周期调控途径 | 第38-43页 |
| ·长日照(LD)促进途径 | 第38-39页 |
| ·光受体对高等植物开花时间的调节 | 第39-41页 |
| ·昼夜节律时间钟和高等植物开花时程的调控 | 第41-43页 |
| 2 春化途径 | 第43-44页 |
| 3 自主调节路径 | 第44页 |
| 4 赤霉素调节路径 | 第44-45页 |
| 5 各种调控途径的相互关联 | 第45-48页 |
| 本项研究的目的和意义 | 第48-49页 |
| 第二章 拟南芥钙调素结合蛋白激酶的功能分析 | 第49-98页 |
| 第一节 拟南芥突变体库的构建和筛选 | 第49-54页 |
| 1 材料和方法 | 第49-53页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第53-54页 |
| 第二节 拟南芥突变体LF1的分析鉴定 | 第54-63页 |
| 1 材料和方法 | 第54-57页 |
| ·突变体的筛选 | 第55页 |
| ·突变体的鉴定 | 第55-57页 |
| ·突变体的鉴定 | 第55-56页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第56页 |
| ·PCR扩增插入片段 | 第56-57页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第57-63页 |
| ·突变体LF1的表型研究 | 第57-58页 |
| ·LF1的插入片段的序列分析 | 第58-60页 |
| ·AtCRK5在晚开花突变体LF1中的作用 | 第60-63页 |
| 第三节 拟南芥钙调素结合蛋白激酶的生化特性研究 | 第63-91页 |
| 1 材料和方法 | 第64-80页 |
| ·昆虫细胞表达载体构建 | 第70页 |
| ·重组表达载体转化DH10Bac | 第70-71页 |
| ·重组杆粒DNA转化Sf9细胞 | 第71页 |
| ·收获重组病毒 | 第71页 |
| ·SDS-PAGE电泳检查目的基因是否表达 | 第71-72页 |
| ·Western blotting检查 | 第72-73页 |
| ·收获细胞并提取蛋白 | 第73页 |
| ·提纯蛋白质(使用磷酸缓冲液) | 第73-75页 |
| ·亲和层析柱的再生 | 第75页 |
| ·Calmodulin Sepharose(?) 4B再生 | 第75-76页 |
| ·从工程菌中纯化重组钙调素 | 第76页 |
| ·生物素标记钙调素(参照Biilingsley，1985) | 第76-77页 |
| ·~(35)S标记CaM(参照Chua和Fromm，1992) | 第77页 |
| ·利用~(35)S标记CaM测定Kd | 第77页 |
| ·钙调素结合蛋白激酶磷酸化、自磷酸化放射自显影分析 | 第77-78页 |
| ·钙调素结合蛋白激酶的酶活测定 | 第78-80页 |
| ·毛细管电泳分析磷酸化氨基酸 | 第80页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第80-91页 |
| ·AtCRK5的钙调素结合特征以及钙调素结合区的定位 | 第80-84页 |
| ·AtCRK5蛋白的纯化和钙调素结合实验 | 第80-82页 |
| ·AtCRK5缺失体蛋白的CaM结合实验和CaM结合区的定位 | 第82-84页 |
| ·AtCRK5的生化特征分析 | 第84-91页 |
| ·AtCRK5全蛋白活性分析 | 第84-85页 |
| ·AtCRK5缺失蛋白酶活分析 | 第85-88页 |
| ·不同条件下AtCRK5的酶活活性分析 | 第88-89页 |
| ·磷酸化氨基酸的分析 | 第89-91页 |
| 第四节 AtCRK5通过GA途径介导拟南芥的开花调控 | 第91-96页 |
| 1 材料和方法 | 第91页 |
| ·长日照／短日照光周期处理 | 第91页 |
| ·春化处理 | 第91页 |
| ·GA处理 | 第91页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第91-96页 |
| ·AtCRK5在晚开花LF1中扮演的角色 | 第91-92页 |
| ·AtCRK5处在LFY的上游调控开花 | 第92-94页 |
| ·晚开花突变体LF1中的LFY和Myb33的表达 | 第94-96页 |
| 讨论 | 第96-98页 |
| 第三章 烟草钙调素依赖型蛋白激酶(NtCaMK1)结构和生化分析 | 第98-152页 |
| 第一节 烟草钙调素依赖型蛋白激酶基因分离与序列分析 | 第99-109页 |
| 1 材料和方法 | 第99-101页 |
| ·基因序列的测定 | 第99页 |
| ·Northern杂交 | 第99-101页 |
| ·NtCaMK1同其它的钙信号系统的蛋白激酶的序列比较 | 第101页 |
| ·利用软件分析NtCaMK1的钙调素结合区 | 第101页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第101-109页 |
| ·NtCaMK1基因序列 | 第101-103页 |
| ·Northern blot结果 | 第103-104页 |
| ·分离NtCaMK1的基因组序列 | 第104-105页 |
| ·利用Omiga软件分析NtCaMK1基因同植物和动物中其它钙相关蛋白激酶基因的比较分析 | 第105-108页 |
| ·NtCaMK1的钙调素结合区的分析 | 第108-109页 |
| 第二节 钙调素依赖型蛋白激酶的钙调素结合性质分析 | 第109-124页 |
| 1 材料和方法 | 第110-119页 |
| ·全基因和缺失突变体表达载体的构建 | 第110-112页 |
| ·蛋白表达载体的构建 | 第112页 |
| ·重组载体转入表达宿主BL21(DE3) | 第112页 |
| ·重组基因在大肠杆菌BL21中的表达 | 第112页 |
| ·诱导蛋白的纯化(大肠杆菌) | 第112-115页 |
| ·从工程菌中纯化重组钙调素 | 第115-116页 |
| ·生物素标记的钙调素结合实验 | 第116-117页 |
| ·~(35)S标记CaM | 第117-118页 |
| ·~(35)S标CaM的检测 | 第118页 |
| ·利用~(35)S标记的CaM测定Kd | 第118页 |
| ·钙调素结合区的点突变实验 | 第118-119页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第119-124页 |
| ·重组NtCaMK1全蛋白在大肠杆曲中的表达 | 第119-120页 |
| ·NtCaMK1钙调素结合实验结果 | 第120-124页 |
| ·NtCaMK1缺失体的CaM结合实验 | 第120-121页 |
| ·钙调素结合区CaMBD的点突变实验结果 | 第121-123页 |
| ·NtCaMK1与CaM的kd常数的测定 | 第123-124页 |
| 第三节 钙调素依赖型蛋白激酶的生化特性分析 | 第124-146页 |
| 1 材料和方法 | 第126-133页 |
| ·表达载体的构建 | 第126-129页 |
| ·提取质粒(煮沸法) | 第126页 |
| ·载体的线性化 | 第126-127页 |
| ·线性化载体的去磷酸化 | 第127页 |
| ·目的基因的获得 | 第127-128页 |
| ·将目的基因连接到pFAST HTb上 | 第128页 |
| ·DH5α感受态细胞的制备 | 第128页 |
| ·连接反应的产物转化DH5α感受态细胞 | 第128页 |
| ·筛选带有目的基因的质粒的菌落 | 第128-129页 |
| ·用PCR和限制性酶内切酶酶切分析，筛选带有正向连接的目的基因的质粒 | 第129页 |
| ·转化DH10Bac感受态细胞，并用蓝／白斑方法筛选转化菌株 | 第129页 |
| ·用碱法提取重组杆粒DNA | 第129页 |
| ·重组杆状质粒转化Sf9昆虫培养细胞 | 第129-130页 |
| ·重组病毒的收获和感染昆虫细胞 | 第130页 |
| ·融合蛋白的表达和纯化 | 第130-132页 |
| ·准备层析柱 | 第130页 |
| ·准备细胞抽提物 | 第130-131页 |
| ·提纯蛋白质 | 第131页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第131-132页 |
| ·亲和层析柱的再生 | 第132页 |
| ·烟草钙调素在大肠杆菌中的表达和纯化(同上) | 第132页 |
| ·CaMK1的自磷酸化分析 | 第132页 |
| ·底物磷酸化反应 | 第132页 |
| ·激酶活性分析 | 第132-133页 |
| ·磷酸化氨基酸的分析 | 第133页 |
| ·自磷酸化后的NtCaMK1的水解和标记 | 第133页 |
| ·标准混合物氨基酸的标记 | 第133页 |
| ·毛细管电泳 | 第133页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第133-146页 |
| ·NtCaMK1蛋白的纯化 | 第133页 |
| ·NtCaMK1蛋白酶活分析 | 第133-136页 |
| ·NtCaMK1的酶动力学结果 | 第136-137页 |
| ·NtCaMK1缺失蛋白酶活分析 | 第137-140页 |
| ·不同CaM亚型对NtCaMK1的激活能力比较 | 第140-142页 |
| ·不同条件下NtCaMK1的底物磷酸化活性的变化情况 | 第142-144页 |
| ·磷酸化氨基酸的分析 | 第144-146页 |
| 第四节 钙调素依赖型蛋白激酶在烟草中的表达模式和转基因研究 | 第146-152页 |
| 1 材料和方法 | 第146-149页 |
| ·实验材料和试剂 | 第146页 |
| ·各种处理方法 | 第146页 |
| ·总RNA的提取 | 第146-147页 |
| ·RNA甲醛变性电泳 | 第147页 |
| ·杂交探针的标记 | 第147-148页 |
| ·Northern blot分析 | 第148-149页 |
| 2 实验结果和讨论 | 第149-152页 |
| ·NtCaMK1在烟草中的Northern blot结果 | 第149页 |
| ·NtCaMK1在各种胁迫情况下的Northern blot结果 | 第149-152页 |
| ·冷处理4℃和热处理42℃对NtCaMK1基因表达的影响 | 第149-150页 |
| ·高盐，干旱，ABA处理对基因表达的影响 | 第150-151页 |
| ·NAA，GA处理对基因表达的影响 | 第151-152页 |
| 第四章 总讨论 | 第152-157页 |
| 参考文献 | 第157-183页 |
| 在读期间发表论文 | 第183-184页 |
| 致谢 | 第184页 |
