| 中文摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 文献综述 | 第10-25页 |
| 1 Bt杀虫晶体蛋白及其基因的研究进展 | 第10-17页 |
| ·苏云金芽孢杆菌的研究历史 | 第10-11页 |
| ·Bt杀虫蛋白基因的分类 | 第11-12页 |
| ·Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能 | 第12-13页 |
| ·Bt杀虫晶体蛋白的作用机理 | 第13-14页 |
| ·对双翅目有杀虫活性蛋白的研究 | 第14-17页 |
| 2 植物Bt抗虫基因工程研究进展 | 第17-23页 |
| ·Bt抗虫植物基因工程发展概况 | 第17-20页 |
| ·提高转基因植物中Bt基因表达的措施 | 第20-23页 |
| ·特异性表达启动子的调控 | 第20-21页 |
| ·基因的修饰与改造 | 第21页 |
| ·利用定位信号提高外源基因表达产物的含量 | 第21页 |
| ·消除位置效应 | 第21-22页 |
| ·将外源基因整合于核外基因组 | 第22-23页 |
| ·内含子在增强基因表达方面的应用 | 第23页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第23-25页 |
| 材料与方法 | 第25-39页 |
| 1 材料与仪器 | 第25-28页 |
| ·材料和菌株 | 第25页 |
| ·质粒和载体 | 第25页 |
| ·重要仪器设备 | 第25-26页 |
| ·重要生化试剂 | 第26-27页 |
| ·抗生素和培养基 | 第27-28页 |
| 2 实验方法 | 第28-39页 |
| ·质粒提取 | 第28页 |
| ·载体构建 | 第28-29页 |
| ·GFM cryllB杀虫基因的设计和人工合成 | 第29-32页 |
| ·Bt GFM cryllB杀虫基因的设计 | 第29-31页 |
| ·基因设计模板的比较与选择 | 第29页 |
| ·Bt GFM cryllB基因编码区的改造原则 | 第29-30页 |
| ·基因两端非编码区序列的设计 | 第30-31页 |
| ·Bt GFM cryllB杀虫基因的人工合成 | 第31-32页 |
| ·GFM cryllB基因合成所需引物 | 第31页 |
| ·连续延伸PCR法合成GFMcryllB | 第31-32页 |
| ·GFM cryllB基因在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第32-34页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第32-33页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第33页 |
| ·包涵体蛋白的可溶性处理 | 第33页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第33页 |
| ·重组蛋白的Thrombin酶切 | 第33-34页 |
| ·抗体的制备及酶标记 | 第34-35页 |
| ·抗原的准备 | 第34页 |
| ·兔的免疫 | 第34页 |
| ·抗血清的制备 | 第34页 |
| ·抗体的纯化 | 第34-35页 |
| ·抗体的酶标记 | 第35页 |
| ·烟草的转化 | 第35-36页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·质粒导入根瘤农杆菌 | 第35页 |
| ·根农杆菌的培养 | 第35页 |
| ·烟草无菌苗的准备 | 第35-36页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第36页 |
| ·转化烟草植株的获得 | 第36页 |
| ·转基因植株的分子检测(PCR检测和Southern blot检测) | 第36-37页 |
| ·烟草叶片DNA提取 | 第36页 |
| ·目的基因的PCR检测 | 第36-37页 |
| ·Southern blot检测 | 第37页 |
| ·转基因植株的ELISA检测 | 第37-39页 |
| ·样品提取方法 | 第37页 |
| ·标准曲线建立和总蛋白含量检测 | 第37页 |
| ·样品ELISA检测 | 第37-39页 |
| 结果与分析 | 第39-53页 |
| 1 Bt GFM cryllB杀虫基因的合成 | 第39-43页 |
| ·设计的signal-GFMcryllB-HDEL基因完整序列 | 第39页 |
| ·人工合成cryllB基因及原始cryllBal基因密码子选择偏向比较 | 第39-41页 |
| ·改造前后两基因碱基GC％含量的变化 | 第41页 |
| ·改造前后两基因的比较 | 第41-42页 |
| ·pBSCH酶切鉴定结果 | 第42页 |
| ·合成的GFMcryllB基因测序结果 | 第42页 |
| ·GFMCryllB蛋白三维模型预测 | 第42-43页 |
| 2 Bt GFM cryllB基因双子叶植物表达载体的构建 | 第43页 |
| 3 GFM cryllB基因细菌表达载体的构建、表达与纯化 | 第43-47页 |
| ·融合蛋白表达载体的构建 | 第43-45页 |
| ·表达中间载体pETC的构建 | 第43-44页 |
| ·表达载体pGC的构建 | 第44-45页 |
| ·融合蛋白的诱导表达与纯化 | 第45-47页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第45页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第45-46页 |
| ·包涵体蛋白的可溶性处理与融合蛋白的纯化 | 第46页 |
| ·融合蛋白的柱上酶切 | 第46-47页 |
| 4 抗体的制备及酶标记 | 第47-49页 |
| ·高效价的CryllB蛋白兔多抗的制备 | 第47页 |
| ·抗体的特异性 | 第47-48页 |
| ·酶标抗体及浓度的选择 | 第48-49页 |
| 5 烟草的转化与检测 | 第49-53页 |
| ·烟草转化苗的获得 | 第49-50页 |
| ·转化植株的分子检测 | 第50-51页 |
| ·PCR检测转基因烟草T_0代 | 第50页 |
| ·转化植株Southern blot检测 | 第50-51页 |
| ·ELISA检测转基因烟草蛋白表达 | 第51-53页 |
| 讨论 | 第53-58页 |
| 1 Bt GFM cryllB杀虫基因的设计 | 第53页 |
| 2 Bt GFM cryllB杀虫基因的合成 | 第53-54页 |
| 3 合成的GFM cryllB基因在E.coli中的表达 | 第54-55页 |
| 4 包涵体溶解与融合蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| 5 GFM cryllB杀虫基因在转基因烟草中的表达 | 第56-57页 |
| 6 需继续开展的研究 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 附录 | 第64-87页 |
| 附录1 现有对双翅目昆虫有杀虫活性的Bt基因毒性实验结果 | 第64-71页 |
| 附录2 GFM cryllB基因全合成所需引物 | 第71-75页 |
| 附录3 GFM cryllB基因合成示意图 | 第75-76页 |
| 附录4 人工合成GFMcryllB基因及原始cryllBal基因核苷酸序列比较 | 第76-78页 |
| 附录5 合成的GFMcryllB基因测序结果 | 第78-83页 |
| 附录6 CryllB蛋白三维结构预测模型(SWISS-MODEL) | 第83-84页 |
| 附录7 pBSCH质粒构建过程图 | 第84-85页 |
| 附录8 pCSCH质粒构建过程图 | 第85-86页 |
| 附录9 pGC质粒构建过程图 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
