| 摘要 | 第1-7页 |
| 前言 | 第7-12页 |
| 第一部分 白细胞介素—6基因的克隆及其在大肠杆菌中表达调控的研究 | 第12-47页 |
| 一 白细胞介素—6基因的克隆 | 第12-27页 |
| 1 材料 | 第12-14页 |
| 2 方法 | 第14-22页 |
| ·人外周血单核细胞的分离与培养 | 第14页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第14页 |
| ·引物的设计与合成纯化 | 第14-15页 |
| ·RT—PCR | 第15-16页 |
| ·IL—6基因的克隆 | 第16-19页 |
| ·IL—6基因的序列测定 | 第19-22页 |
| 3 结果 | 第22-27页 |
| ·细胞总RNA的抽提与RT-PCR | 第22-23页 |
| ·pUC18-IL-6质粒的构建 | 第23-24页 |
| ·hIL-6 cDNA的全序列分析 | 第24-27页 |
| 二 白细胞介素—6的基因定点突变 | 第27-31页 |
| 1 材料 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-28页 |
| ·引物的设计与合成 | 第27页 |
| ·突变PCR的方法及原理 | 第27-28页 |
| 3 结果 | 第28-31页 |
| ·突变PCR进行定点突变 | 第28-30页 |
| ·PCR突变产物的序列测定 | 第30-31页 |
| 三 白细胞介素—6基因的表达与调控 | 第31-41页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| 2 方法 | 第32-34页 |
| ·外源基因的诱导表达 | 第32页 |
| ·蛋白质的SDS-PAGE电泳 | 第32页 |
| ·Western blot | 第32-34页 |
| 3 结果 | 第34-41页 |
| ·IL-6表达与调控的引物设计与质粒构建 | 第34-36页 |
| ·SD序列到ATG之间碱基的序列测定 | 第36-39页 |
| ·pBV220-IL-6(1—6)表达载体的构建及其在大肠杆菌DH5α中的表达 | 第39-40页 |
| ·Western blot | 第40-41页 |
| 四 讨论 | 第41-47页 |
| 第二部分 白细胞介素—6中试生产工艺的初探 | 第47-66页 |
| 一 白细胞介素—6发酵纯化及检定 | 第47-61页 |
| 1 材料 | 第47页 |
| 2 方法 | 第47-51页 |
| ·白细胞介素—6的发酵 | 第47页 |
| ·包涵体的提取与纯化 | 第47-48页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第48页 |
| ·包涵体的变性与复性 | 第48页 |
| ·复性后IL-6的纯化 | 第48-49页 |
| ·rhIL-6的活性测定 | 第49页 |
| ·rhIL-6的纯度测定 | 第49页 |
| ·HPLC检测 | 第49页 |
| ·SDS-PAGE银染分析 | 第49页 |
| ·N末端氨基酸序列分析 | 第49页 |
| ·rhIL-6等电点的测定 | 第49-51页 |
| 3 结果 | 第51-61页 |
| ·pBV220-IL-6(1)的发酵 | 第51-52页 |
| ·包涵体纯度对rhIL-6复性及纯化的影响 | 第52-54页 |
| ·表达产物的纯化 | 第54-57页 |
| ·rhIL-6的生物学活性测定 | 第57-58页 |
| ·纯化后rhIL-6的纯度测定 | 第58-59页 |
| ·rhIL-6蛋白等电点的测定 | 第59-60页 |
| ·N末端氨基酸序列测定结果 | 第60页 |
| ·包涵体变性复性及纯化后的得率 | 第60-61页 |
| 二 讨论 | 第61-66页 |
| 参考文献 | 第66-69页 |
| 小结 | 第69页 |
| 展望 | 第69-70页 |
| 综述 | 第70-81页 |
| 参考文献 | 第81-84页 |
| 附录1 主要溶液的配制 | 第84-89页 |
| 附录2 IL-6N末端氨基酸测序结果 | 第89-90页 |
| 附录3 英文缩写词 | 第90-92页 |
| 作者简历 | 第92-95页 |
| 致谢 | 第95页 |