| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-9页 |
| 引言 | 第9-13页 |
| 第一部分 HV1基因的化学合成与克隆 | 第13-30页 |
| 一、材料 | 第13-14页 |
| 二、方法 | 第14-23页 |
| 1．水蛭素HV1基因的化学合成 | 第14-15页 |
| 2．合成寡核苷酸片段的纯化 | 第15-16页 |
| 3．寡核苷酸片段纯度的检测 | 第16页 |
| 4．寡核苷酸片段5′端磷酸化 | 第16页 |
| 5．退火 | 第16-17页 |
| 6．连接 | 第17页 |
| 7．连接效果检查 | 第17页 |
| 8．PCR扩增目的基因 | 第17页 |
| 9．扩增产物检测 | 第17页 |
| 10．PCR产物末端补平 | 第17-18页 |
| 11．pBS-SK(+)质粒提取 | 第18页 |
| 12．质粒DNA的酶切 | 第18页 |
| 13．基因和载体连接 | 第18-19页 |
| 14．感受态细胞制备 | 第19页 |
| 15．转化 | 第19页 |
| 16．重组质粒杂交筛选 | 第19-20页 |
| 17．重组质粒酶切鉴定 | 第20页 |
| 18．重组质粒DNA大量制备 | 第20-21页 |
| 19．质粒的PEG沉淀法纯化 | 第21页 |
| 20．质粒的氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化 | 第21-22页 |
| 21．核苷酸序列测定 | 第22-23页 |
| 三、结果与分析 | 第23-30页 |
| 1．HV1基因寡核苷酸片段的产率 | 第23-24页 |
| 2．寡核苷酸片段纯化后的回收率 | 第24-25页 |
| 3．寡核苷酸片段的纯度 | 第25页 |
| 4．HV1基因片段连接产物的多型性 | 第25-26页 |
| 5．PCR获得的水蛭素HV全基因 | 第26-27页 |
| 6．筛选的含目的基因的重组质粒 | 第27页 |
| 7．重组质粒酶切鉴定图谱 | 第27-29页 |
| 8．HV1基因核苷酸序列 | 第29-30页 |
| 第二部分 HV1基因在酵母中的表达 | 第30-44页 |
| 一、材料 | 第30-31页 |
| 二、方法 | 第31-36页 |
| 1．α因子前导肽基因的扩增 | 第31-32页 |
| 2．DNA片段低熔点琼脂糖凝胶回收 | 第32页 |
| 3．前导肽基因的克隆 | 第32页 |
| 4．质粒PCR检测 | 第32页 |
| 5．质粒酶切鉴定 | 第32页 |
| 6．前导肽基因核苷酸序列测定 | 第32-33页 |
| 7．HV1基因与前导肽基因连接 | 第33页 |
| 8．酵母表达载体pYC-DE-2 EcoRI酶切片段的末端去磷酸化 | 第33页 |
| 9．表达质粒构建及转化 | 第33页 |
| 10．HB_(101)感受态细胞制备 | 第33-34页 |
| 11．表达质粒酶切鉴定 | 第34页 |
| 12．菌种保存 | 第34页 |
| 13．酵母细胞LiAC转化 | 第34页 |
| 14．小牛胸腺DNA制备 | 第34-35页 |
| 15．酵母细胞电脉冲转化 | 第35页 |
| 16．酵母质粒微量提取 | 第35-36页 |
| 17．酵母质粒鉴定 | 第36页 |
| 18．酵母菌的培养及表达产物的生物学活性测定 | 第36页 |
| 19．酵母菌种保存 | 第36页 |
| 三、结果与分析 | 第36-44页 |
| 1．扩增的α因子前导肽基因 | 第36-37页 |
| 2．含前导肽基因的重组质粒PCR检测图谱 | 第37-38页 |
| 3．前导肽基因克隆质粒酶切图谱 | 第38-40页 |
| 4．前导肽基因核苷酸序列 | 第40页 |
| 5．HV1基因与前导肽基因连接的酶切图谱 | 第40-41页 |
| 6．表达质粒酶切图谱 | 第41-42页 |
| 7．重组酵母质粒鉴定结果 | 第42-43页 |
| 8．表达产物的抗凝活性及产率 | 第43-44页 |
| 第三部分 HV1基因在酵母中表达产物纯化的研究 | 第44-56页 |
| 一、材料 | 第44页 |
| 二、方法 | 第44-47页 |
| 1．菌株培养 | 第44页 |
| 2．硫酸铵沉淀 | 第44页 |
| 3．凝胶过滤 | 第44-45页 |
| 4．阴离子交换层析 | 第45页 |
| 5．透析及浓缩 | 第45页 |
| 6．HPLC阳离子交换层析脱色 | 第45页 |
| 7．HPLC反相层析纯化 | 第45页 |
| 8．HPLC凝胶过滤 | 第45页 |
| 9．蛋白浓度测定 | 第45-46页 |
| 10．ME-SDS-PAGE | 第46-47页 |
| 11．SDS聚丙烯酰胺凝胶考马斯亮蓝R250染色 | 第47页 |
| 12．N末端氨基酸序列分析 | 第47页 |
| 三、结果与分析 | 第47-56页 |
| 1．不同培养基水蛭素的表达时间 | 第47页 |
| 2．硫酸铵沉淀的最佳饱和度 | 第47-48页 |
| 3．粗制品分离纯化图 | 第48-49页 |
| 4．阴离子交换层析图 | 第49-50页 |
| 5．HPLC阳离子交换层析图 | 第50-51页 |
| 6．HPLC反相层析图 | 第51页 |
| 7．二次纯化图 | 第51-52页 |
| 8．YEPD培养基产率 | 第52-53页 |
| 9．选择性培养基产率 | 第53页 |
| 10．水蛭素SDS-PAGE图谱 | 第53-54页 |
| 11．N末端氨基酸序列 | 第54-56页 |
| 讨论 | 第56-65页 |
| 一、选择水蛭素变异体HV1的考虑 | 第56页 |
| 二、影响基因合成的因素 | 第56-57页 |
| 三、基因扩增及克隆过程中的突变问题 | 第57页 |
| 四、全基因克隆的难点及原因分析 | 第57-59页 |
| 五、α因子前导肽基因的选择 | 第59-61页 |
| 六、表达系统的评价 | 第61-62页 |
| 七、rHV1纯化的关键性问题分析 | 第62-63页 |
| 八、实验结果评价及分析 | 第63-65页 |
| 小结 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-70页 |
| 缩写词 | 第70-74页 |
| 主要溶液配方 | 第74-80页 |
| 个人简历 | 第80-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 综述 | 第83-92页 |