| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-17页 |
| 第1章 绪论 | 第17-40页 |
| ·课题背景及研究的目的和意义 | 第17-18页 |
| ·国内外研究综述 | 第18-38页 |
| ·生物农药的研究进展 | 第18-21页 |
| ·毛壳菌生防能力的研究现状及意义 | 第21-25页 |
| ·几丁质酶分类及酶学特性研究进展 | 第25-29页 |
| ·酵母表达系统的研究概况 | 第29-34页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母系统中高效表达的因素 | 第34-38页 |
| ·存在的问题 | 第38-39页 |
| ·课题的来源及主要研究内容 | 第39-40页 |
| ·课题来源 | 第39页 |
| ·主要研究内容 | 第39-40页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第40-65页 |
| ·实验材料 | 第40-45页 |
| ·菌株和质粒 | 第40页 |
| ·培养基 | 第40-42页 |
| ·酶和试剂 | 第42-44页 |
| ·仪器设备 | 第44-45页 |
| ·实验方法 | 第45-65页 |
| ·角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因的诱导表达 | 第45-46页 |
| ·角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因克隆及序列分析 | 第46-49页 |
| ·酿酒酵母表达载体的构建与鉴定 | 第49-51页 |
| ·毕赤酵母表达载体的构建与鉴定 | 第51-53页 |
| ·Chi58 基因密码子改造突变体的构建 | 第53-55页 |
| ·Chi58 基因多拷贝整合转化子的获得 | 第55-56页 |
| ·Chi58 基因几丁质结合域缺失突变体的构建 | 第56-58页 |
| ·重组几丁质酶活性测定及酶学特性分析 | 第58-61页 |
| ·重组几丁质酶SDS-PAGE 及酶谱分析 | 第61-62页 |
| ·重组几丁质酶的诱导表达及发酵条件优化 | 第62-63页 |
| ·重组几丁质酶转化子与病原菌的室内拮抗试验 | 第63-65页 |
| 第3章 角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因的克隆及序列分析 | 第65-79页 |
| ·角毛壳菌几丁质酶的诱导表达 | 第65-66页 |
| ·不同碳源对角毛壳菌几丁质酶的诱导表达 | 第65-66页 |
| ·半定量RT-PCR 分析Chi58 基因的表达量 | 第66页 |
| ·Chi58 基因全长序列获得及生物信息学分析 | 第66-76页 |
| ·Chi58 基因全长DNA 序列的获得 | 第66-69页 |
| ·Chi58 基因序列同源性比对及保守区预测 | 第69-70页 |
| ·CHI58 氨基酸组成分析 | 第70-71页 |
| ·CHI58 信号肽预测 | 第71-72页 |
| ·CHI58 多序列比对 | 第72-74页 |
| ·CHI58 氨基酸结构域预测 | 第74-75页 |
| ·CHI58 系统进化树的构建 | 第75-76页 |
| ·Chi58 基因的诱导表达与序列分析的讨论 | 第76-77页 |
| ·几丁质酶与生物防治 | 第76页 |
| ·应用反向PCR 方法获得全长DNA 序列 | 第76-77页 |
| ·几丁质酶基因及推导氨基酸序列的生物信息学分析 | 第77页 |
| ·本章小结 | 第77-79页 |
| 第4章 角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因在酵母系统中的表达研究 | 第79-94页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因的酿酒酵母转化及表达 | 第79-82页 |
| ·几丁质酶 Chi58 基因的扩增及与 pYES2 载体的连接 | 第79-80页 |
| ·酿酒酵母 H158 的生长曲线测定 | 第80-81页 |
| ·几丁质酶基因Chi58 的酿酒酵母转化及鉴定 | 第81页 |
| ·酿酒酵母转化子几丁质酶活性检测 | 第81-82页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因的毕赤酵母转化及表达 | 第82-88页 |
| ·几丁质酶Chi58 的扩增及表达载体的构建 | 第82-83页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因在毕赤酵母中的转化 | 第83-84页 |
| ·转化子产酶最适pH 值的测定 | 第84页 |
| ·转化子最适发酵时间的测定 | 第84-85页 |
| ·转化子产酶最适温度的测定 | 第85页 |
| ·转化子产酶热稳定性的测定 | 第85-86页 |
| ·不同底物对几丁质酶活性的影响 | 第86页 |
| ·不同金属离子及化合物对几丁质酶活性的影响 | 第86-87页 |
| ·转化子遗传稳定性分析 | 第87页 |
| ·SDS-PAGE 及酶谱鉴定 | 第87-88页 |
| ·几丁质酶CHI58 酶学特性及表达分析 | 第88-93页 |
| ·几丁质酶CHI58 在两种酵母系统中的表达分析 | 第88-89页 |
| ·载体构建及毕赤酵母转化 | 第89-90页 |
| ·几丁质酶CHI58 酶学特性分析 | 第90-92页 |
| ·酶谱分析及蛋白活性电泳 | 第92-93页 |
| ·本章小结 | 第93-94页 |
| 第5章 几丁质酶Chi58 基因在毕赤酵母中的高效表达研究 | 第94-116页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因密码子改造的研究 | 第94-103页 |
| ·毕赤酵母表达系统对外源基因密码子选择的偏爱性 | 第94-95页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因密码子使用分析 | 第95-97页 |
| ·几丁质酶CHI58A 三级结构分析 | 第97-98页 |
| ·几丁质酶基因Chi58A 的密码子改造及鉴定 | 第98-99页 |
| ·毕赤酵母表达载体的构建 | 第99-100页 |
| ·电转化毕赤酵母 GS115 及转化子的筛选 | 第100-101页 |
| ·几丁质酶活性的比较分析 | 第101-102页 |
| ·SDS-PAGE 比较分析 | 第102页 |
| ·重组酵母的遗传稳定性分析 | 第102-103页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因多拷贝整合的研究 | 第103-105页 |
| ·G418 筛选不同拷贝数的转化子 | 第103-104页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因的二次转化 | 第104-105页 |
| ·发酵条件优化 | 第105-109页 |
| ·菌体初始接种量对几丁质酶表达量的影响 | 第105-106页 |
| ·不同pH 值对外源蛋白表达的影响 | 第106-107页 |
| ·诱导阶段甲醇浓度对蛋白表达量的影响 | 第107页 |
| ·油酸对蛋白表达量的影响 | 第107-108页 |
| ·正交设计法优化培养基配方试验 | 第108-109页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因高效表达的讨论 | 第109-115页 |
| ·密码子选择的偏爱性对几丁质酶 CHI58 表达量的影响 | 第109-110页 |
| ·SOE-PCR 方法在密码子改造中的应用 | 第110-112页 |
| ·几丁质酶Chi58 基因多拷贝整合对表达量的影响 | 第112页 |
| ·几丁质酶 Chi58 基因多拷贝整合对表达量的影响 | 第112-115页 |
| ·本章小结 | 第115-116页 |
| 第6章 几丁质酶Chi58 基因结构域的功能验证及抑菌效能研究 | 第116-136页 |
| ·几丁质酶 CHI58 分子结构预测 | 第116-119页 |
| ·CHI58 结构域预测 | 第116-117页 |
| ·CHI58 二级结构预测 | 第117-118页 |
| ·CHI58D 三级结构预测 | 第118-119页 |
| ·ChBD 缺失突变体的构建及在毕赤酵母中的转化 | 第119-122页 |
| ·结构域缺失突变体的构建 | 第119-120页 |
| ·结构域缺失突变体Chi58D 表达载体的构建 | 第120页 |
| ·转化毕赤酵母及其表型鉴定 | 第120-121页 |
| ·SDS-PAGE 比较分析 | 第121-122页 |
| ·转化子的几丁质酶活性检测 | 第122-125页 |
| ·基于可溶性底物的几丁质酶活性检测 | 第122-123页 |
| ·基于不溶性底物的几丁质酶活性检测 | 第123页 |
| ·以真菌细胞壁为底物的几丁质酶活性检测 | 第123-124页 |
| ·CHI58 与 CHI58D 最适温度与最适 pH 值的比较 | 第124-125页 |
| ·基因工程菌株发酵液对植物病原菌的抑制作用 | 第125-127页 |
| ·应用含毒介质法测定抑菌效果的研究 | 第125-126页 |
| ·应用平板打孔法测定抑菌效果的研究 | 第126-127页 |
| ·角毛壳菌与植物病原菌的室内拮抗试验 | 第127-131页 |
| ·角毛壳菌对立枯丝核菌的拮抗作用 | 第127-128页 |
| ·角毛壳菌对杨树叶枯病菌的拮抗作用 | 第128-129页 |
| ·角毛壳菌对核盘菌的拮抗作用 | 第129页 |
| ·角毛壳菌对杨树烂皮病菌的拮抗作用 | 第129-130页 |
| ·角毛壳菌对尖孢镰刀菌的拮抗作用 | 第130-131页 |
| ·几丁质酶基因结构域及其抑菌活性分析 | 第131-135页 |
| ·几丁质酶几丁质结合域分析 | 第131-133页 |
| ·几丁质酶抑菌活性分析 | 第133-135页 |
| ·本章小结 | 第135-136页 |
| 结论 | 第136-138页 |
| 参考文献 | 第138-155页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 | 第155-157页 |
| 致谢 | 第157-158页 |
| 个人简历 | 第158页 |
