| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第13-35页 |
| 1.1 引言 | 第13页 |
| 1.2 纳豆的简介 | 第13-14页 |
| 1.2.1 纳豆的理化性质 | 第14页 |
| 1.2.2 纳豆的营养成分和功效 | 第14页 |
| 1.3 纳豆激酶的概述 | 第14-26页 |
| 1.3.1 纳豆激酶的结构及理化性质 | 第15-16页 |
| 1.3.2 纳豆激酶的药理作用及其作用机制 | 第16-21页 |
| 1.3.3 纳豆激酶的临床人体研究 | 第21-23页 |
| 1.3.4 纳豆激酶的研究进展 | 第23-24页 |
| 1.3.5 纳豆激酶的未来发展及挑战 | 第24-26页 |
| 1.4 纳豆激酶活性研究 | 第26-30页 |
| 1.4.1 前肽对NK酶活的影响 | 第26-28页 |
| 1.4.2 纳豆激酶酶活检测方法的研究 | 第28-30页 |
| 1.5 基因表达体系 | 第30-32页 |
| 1.5.1 原核基因表达系统 | 第30页 |
| 1.5.2 真核基因表达系统 | 第30-31页 |
| 1.5.3 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第31-32页 |
| 1.6 本文研究意义与内容 | 第32-35页 |
| 第2章 纳豆激酶枯草芽孢杆菌表达菌株的构建 | 第35-57页 |
| 2.0 前言 | 第35页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-38页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第35页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第35-36页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第36-37页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第37-38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-44页 |
| 2.2.1 基因组DNA和质粒DNA提取 | 第38页 |
| 2.2.2 PCR扩增目的基因片段 | 第38-39页 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α超级感受态细胞制备 | 第39-40页 |
| 2.2.4 热激法转化至大肠杆菌DH5α | 第40-41页 |
| 2.2.5 WB800N感受态细胞制备 | 第41页 |
| 2.2.6 电转化法转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞 | 第41页 |
| 2.2.7 Bam H I和 Sma I酶切反应体系 | 第41-42页 |
| 2.2.8 T4 DNA Ligase连接反应体系 | 第42页 |
| 2.2.9 重组枯草芽孢杆菌菌株的验证法 | 第42-43页 |
| 2.2.10 重组枯草芽孢杆菌的诱导表达 | 第43页 |
| 2.2.11 重组菌株表达产物的表达量及纤溶酶活检测 | 第43-44页 |
| 2.3 结果与分析 | 第44-55页 |
| 2.3.1 基因组和质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析 | 第44页 |
| 2.3.2 PCR扩增纳豆激酶基因序列分析 | 第44-46页 |
| 2.3.3 目的基因和质粒双酶切凝胶电泳分析 | 第46-47页 |
| 2.3.4 连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中结果分析 | 第47-48页 |
| 2.3.5 重组质粒双酶切法验证分析 | 第48-49页 |
| 2.3.6 重组质粒基因测序法验证分析 | 第49-51页 |
| 2.3.7 重组枯草芽孢杆菌PCR扩增验证分析 | 第51-52页 |
| 2.3.8 重组枯草芽孢杆菌表达产物SDS-PAGE电泳分析 | 第52页 |
| 2.3.9 琼脂糖-纤维平板法对表达产物酶活分析 | 第52-55页 |
| 2.4 讨论 | 第55-56页 |
| 2.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 第3章 重组枯草芽孢杆菌表达条件优化 | 第57-71页 |
| 3.0 前言 | 第57页 |
| 3.1 实验耗材 | 第57-58页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第57页 |
| 3.1.2 主要试剂的配制 | 第57-58页 |
| 3.2 实验方法 | 第58-61页 |
| 3.2.1 琼脂糖-纤维蛋白平板的制备 | 第58页 |
| 3.2.2 尿激酶标准曲线的绘制 | 第58-59页 |
| 3.2.3 SDS-PAGE检测表达产物 | 第59-60页 |
| 3.2.4 摇瓶发酵基础培养 | 第60页 |
| 3.2.5 不同因素对重组菌株的表达影响 | 第60-61页 |
| 3.3 结果与分析 | 第61-69页 |
| 3.3.1 尿激酶标准曲线 | 第61-62页 |
| 3.3.2 不同IPTG浓度对纳豆激酶活性影响分析 | 第62-63页 |
| 3.3.3 不同温度对NK表达影响分析 | 第63页 |
| 3.3.4 发酵时间与NK表达分析 | 第63-67页 |
| 3.3.5 诱导时期对纳豆激酶活性影响分析 | 第67页 |
| 3.3.6 培养基初始pH值对酶活性影响分析 | 第67-69页 |
| 3.4 讨论 | 第69-70页 |
| 3.5 本章小结 | 第70-71页 |
| 第4章 重组枯草芽孢杆菌发酵培养条件优化 | 第71-85页 |
| 4.0 前言 | 第71页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第71-72页 |
| 4.1.1 菌种 | 第71-72页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第72页 |
| 4.1.3 培养基 | 第72页 |
| 4.2 实验方法 | 第72-74页 |
| 4.2.1 种子液培养 | 第72-73页 |
| 4.2.2 基础发酵条件 | 第73页 |
| 4.2.3 单因素实验 | 第73页 |
| 4.2.4 Box-Behnken实验设计和响应面分析 | 第73页 |
| 4.2.5 NK酶活检测 | 第73-74页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第74-83页 |
| 4.3.1 不同碳源和氮源对NK酶活性的影响 | 第74-75页 |
| 4.3.2 不同浓度碳源和氮源浓度对NK酶活的影响 | 第75页 |
| 4.3.3 不同金属盐离子浓度对NK酶活性的影响 | 第75-76页 |
| 4.3.4 不同接种量对NK酶活的影响 | 第76-78页 |
| 4.3.5 响应面实验因素水平设计 | 第78-80页 |
| 4.3.6 模型建立及显著性分析 | 第80-81页 |
| 4.3.7 响应面分析 | 第81-83页 |
| 4.4 本章小结 | 第83-85页 |
| 第5章 结论与展望 | 第85-87页 |
| 5.1 结论 | 第85-86页 |
| 5.2 展望 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-99页 |
| 攻读硕士期间已发表的论文 | 第99-101页 |
| 致谢 | 第101页 |
