| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-22页 |
| ·CagT——幽门螺杆菌cag致病岛的"底座" | 第14-18页 |
| ·cagT基因特性及流行病学 | 第14-15页 |
| ·CagT蛋白特性 | 第15-16页 |
| ·CagT在的cag PAI的定位及可能功能分析 | 第16页 |
| ·结语 | 第16-18页 |
| ·CagM——幽门螺杆菌cag致病岛效应分子CagA转运的关键蛋白 | 第18-22页 |
| ·cag PAI与疾病的关系 | 第18页 |
| ·cagM基因特性及流行病学 | 第18-19页 |
| ·CagM蛋白特性 | 第19页 |
| ·CagM在cag PAI的功能研究 | 第19-20页 |
| ·结语 | 第20-22页 |
| 第2章 前言 | 第22-24页 |
| 第3章 幽门螺杆菌CagM、CagT及CagA蛋白的克隆、表达、纯化及免疫反应性研究 | 第24-60页 |
| 实验材料 | 第24-31页 |
| 第一部分 CagM蛋白的克隆、表达、纯化及免疫反应性研究 | 第31-43页 |
| 实验方法 | 第31-39页 |
| 一、幽门螺杆菌26695菌株的培养 | 第31页 |
| 二、幽门螺杆菌26695菌株基因组DNA的制备 | 第31页 |
| 三、PCR扩增cagM基因 | 第31-33页 |
| 四、重组质粒pMD19-cagM的构建 | 第33-35页 |
| 五、重组质粒pQE30-cagM的构建 | 第35-36页 |
| 六、基因碱基序列测定 | 第36页 |
| 七、pQE30-cagM在E. coli M15中的表达 | 第36页 |
| 八、CagM表达形式的鉴定 | 第36-37页 |
| 九、CagM重组蛋白包涵体的洗涤 | 第37页 |
| 十、CagM重组蛋白的纯化 | 第37页 |
| 十一、纯化后样品的处理 | 第37-38页 |
| 十二、CagM抗血清的制备 | 第38页 |
| 十三、CagM免疫效果检测 | 第38-39页 |
| 十四、抗体纯化 | 第39页 |
| 结果 | 第39-41页 |
| 一、cagM基因PCR扩增结果 | 第39页 |
| 二、重组质粒pMD19-cagM、pQE30-cagM的鉴定 | 第39-40页 |
| 三、cagM基因核苷酸序列测定 | 第40页 |
| 四、CagM重组蛋白的表达与纯化 | 第40-41页 |
| 五、重组蛋白的免疫学活性检测 | 第41页 |
| 讨论 | 第41-43页 |
| 第二部分 CagT蛋白的克隆、表达、纯化及免疫反应性研究 | 第43-52页 |
| 实验方法 | 第43-47页 |
| 一、幽门螺杆菌26695菌株的培养及基因组DNA的制备 | 第43页 |
| 二、PCR扩增cagT基因 | 第43-44页 |
| 三、重组质粒pMD19-cagT的构建 | 第44-45页 |
| 四、重组质粒pET-28a(+)-cagT的构建 | 第45-46页 |
| 五、基因碱基序列测定 | 第46页 |
| 六、pET-28a(+)-cagT在E. coli BL21中的表达 | 第46页 |
| 七、CagT表达形式的鉴定 | 第46页 |
| 八、CagT重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| 九、纯化后样品的处理 | 第47页 |
| 十、CagT抗血清的制备 | 第47页 |
| 十一、CagT免疫效果检测 | 第47页 |
| 十二、抗体纯化 | 第47页 |
| 结果 | 第47-50页 |
| 一、cagT基因PCR扩增结果 | 第47-48页 |
| 二、重组质粒pMD19-cagT、pET-28a(+)-cagT的鉴定 | 第48页 |
| 三、cagT基因核苷酸序列测定分析 | 第48页 |
| 四、CagT重组蛋白的表达与纯化 | 第48-49页 |
| 五、重组蛋白的免疫学活性检测 | 第49-50页 |
| 讨论 | 第50-52页 |
| 第三部分 CagA蛋白羧基端的克隆、表达、纯化及免疫反应性研究 | 第52-60页 |
| 实验方法 | 第52-55页 |
| 一、幽门螺杆菌26695菌株的培养及基因组DNA的制备 | 第52页 |
| 二、PCR扩增cagA-C片段 | 第52-53页 |
| 三、重组质粒pMD19-cagA-C的构建 | 第53-54页 |
| 四、重组质粒pET-30a(+)-cagA-C的构建 | 第54页 |
| 五、基因碱基序列测定 | 第54页 |
| 六、pET-30a(+)-cagA-C在E. coli BL21中的表达及表达形式鉴定 | 第54-55页 |
| 七、CagA-C重组蛋白的纯化 | 第55页 |
| 八、纯化后样品的处理 | 第55页 |
| 九、CagA-C抗血清的制备 | 第55页 |
| 十、CagA-C免疫效果检测 | 第55页 |
| 十一、抗体纯化 | 第55页 |
| 结果 | 第55-58页 |
| 一、cagA-C基因片段PCR扩增结果 | 第55-56页 |
| 二、重组质粒pMD19-cagA-C、pET-30a(+)-cagA-C的鉴定 | 第56页 |
| 三、cagA-C片段核苷酸序列测定 | 第56页 |
| 四、CagA-C重组蛋白的表达与纯化 | 第56-57页 |
| 五、重组蛋白的免疫学活性检测 | 第57-58页 |
| 讨论 | 第58-60页 |
| 第4章 cagM、cagT与cagA基因缺失菌株的构建与鉴定 | 第60-92页 |
| 实验材料 | 第60-66页 |
| 第一部分 幽门螺杆菌26695菌株cagM基因缺失株的构建与鉴定 | 第66-77页 |
| 实验方法 | 第66-72页 |
| 一、幽门螺杆菌26695和11637菌株的培养及基因组DNA的制备 | 第66页 |
| 二、cagM基因缺失株的构建策略(图4-1) | 第66-67页 |
| 三、同源序列片段引物的合成 | 第67页 |
| 四、左右同源臂序列的PCR扩增 | 第67页 |
| 五、PCR产物的回收 | 第67页 |
| 六、左右同源臂PCR产物的克隆 | 第67-69页 |
| 七、目的片段的获得 | 第69页 |
| 八、抗性基因及线性自杀质粒的连接 | 第69页 |
| 九、基因敲除用自杀质粒的构建及鉴定 | 第69-71页 |
| 十、基因敲除菌株的构建及鉴定 | 第71-72页 |
| 结果 | 第72-75页 |
| 一、cagM基因敲除质粒pBSKΔcagM的构建及酶切鉴定 | 第72-73页 |
| 二、基因缺失突变菌株26695ΔcagM的构建与鉴定 | 第73-75页 |
| 讨论 | 第75-77页 |
| 第二部分 幽门螺杆菌26695菌株cagT基因缺失株的构建与鉴定 | 第77-85页 |
| 实验方法 | 第77-81页 |
| 一、幽门螺杆菌26695和11637菌株的培养及基因组DNA的制备 | 第77页 |
| 二、cagT基因缺失株的构建策略(图4-6) | 第77-78页 |
| 三、同源序列片段引物的合成 | 第78页 |
| 四、左右同源臂序列的PCR扩增 | 第78页 |
| 五、PCR产物的回收 | 第78页 |
| 六、左右同源臂PCR产物的克隆 | 第78-79页 |
| 七、目的片段的获得 | 第79页 |
| 八、基因敲除用自杀质粒的构建及鉴定 | 第79-80页 |
| 九、基因敲除菌株的构建及鉴定 | 第80-81页 |
| 结果 | 第81-83页 |
| 一、cagT基因敲除质粒pBSKΔcagT构建及酶切鉴定 | 第81-82页 |
| 二、基因缺失突变菌株26695ΔcagT的构建与鉴定 | 第82-83页 |
| 讨论 | 第83-85页 |
| 第三部分 幽门螺杆菌26695菌株cagA基因缺失株的构建与鉴定 | 第85-92页 |
| 实验方法 | 第85-89页 |
| 一、幽门螺杆菌26695和11637菌株的培养及基因组DNA的制备 | 第85页 |
| 二、cagA基因缺失株的构建策略(图4-11) | 第85-86页 |
| 三、同源序列片段引物的合成 | 第86页 |
| 四、左右同源臂序列的PCR扩增 | 第86页 |
| 五、PCR产物的回收 | 第86页 |
| 六、左右同源臂PCR产物的克隆 | 第86-87页 |
| 七、目的片段的获得 | 第87页 |
| 八、基因敲除用自杀质粒的构建及鉴定 | 第87-88页 |
| 九、基因敲除菌株的构建及鉴定 | 第88-89页 |
| 结果和讨论 | 第89-92页 |
| 一、cagA基因敲除质粒pBSKΔcagA的构建及酶切鉴定 | 第89-90页 |
| 二、基因缺失突变菌株26695ΔcagA的构建与鉴定 | 第90-92页 |
| 第5章 CagM和CagT蛋白对CagA转运至宿主细胞的影响和宿主细胞分泌IL-8的影响 | 第92-102页 |
| 实验材料 | 第92-96页 |
| 实验方法 | 第96-97页 |
| 一、幽门螺杆菌菌株的培养 | 第96页 |
| 二、CagA蛋白的转运及磷酸化试验 | 第96页 |
| 三、IL-8检测试验 | 第96-97页 |
| 结果 | 第97-99页 |
| 一、CagT及CagM蛋白对CagA转运和磷酸化的影响 | 第97-98页 |
| 二、CagT及CagM蛋白对AGS细胞IL-8分泌的影响 | 第98-99页 |
| 讨论 | 第99-102页 |
| 第6章 幽门螺杆菌CagM、CagT蛋白的生物学特性及功能研究 | 第102-116页 |
| 实验材料 | 第102-106页 |
| 实验方法 | 第106-108页 |
| 一、幽门螺杆菌的培养 | 第106页 |
| 二、CagT和CagM蛋白在幽门螺杆菌中的修饰和分子大小变化鉴定 | 第106页 |
| 三、CagT和CagM蛋白在cag PAI的亚细胞定位鉴定 | 第106-107页 |
| 四、CagT和CagM蛋白分泌至胞外的免疫沉淀试验 | 第107页 |
| 五、CagT与CagA、CagM与CagA的免疫共沉淀 | 第107-108页 |
| 六、CagM对CagT蛋白表达的影响鉴定 | 第108页 |
| 结果 | 第108-113页 |
| 一、CagT和CagM蛋白在幽门螺杆菌中的修饰和分子大小变化鉴定 | 第108-109页 |
| 二、CagT和CagM蛋白在cag PAI的亚细胞定位鉴定 | 第109-110页 |
| 三、CagT和CagM蛋白不能分泌至细菌细胞外 | 第110-111页 |
| 四、CagA、CagT及CagM蛋白之间的相互作用 | 第111-112页 |
| 五、CagM对CagT蛋白表达的影响 | 第112-113页 |
| 讨论 | 第113-116页 |
| 全文总结 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-126页 |
| 缩略语 | 第126-128页 |
| 致谢 | 第128-130页 |
| 攻读博士期间发表论文 | 第130-131页 |
