豆豉纤溶酶定向进化及突变酶基因的表达研究
| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-13页 |
| 缩略词 | 第13-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-42页 |
| ·溶栓剂研究进展 | 第14-23页 |
| ·第一代溶栓剂 | 第14-15页 |
| ·第二代溶栓剂 | 第15-16页 |
| ·第三代溶栓剂 | 第16-18页 |
| ·动物来源的新型溶栓剂 | 第18-21页 |
| ·微生物来源的新型溶栓剂 | 第21-22页 |
| ·植物来源的新型溶栓剂 | 第22页 |
| ·新型溶栓剂的发展趋势 | 第22-23页 |
| ·豆豉纤溶酶研究进展 | 第23-29页 |
| ·豆豉纤溶酶产生菌的筛选 | 第23-24页 |
| ·豆豉纤溶酶的同源性分析 | 第24页 |
| ·豆豉纤溶酶活性测定方法 | 第24-26页 |
| ·豆豉纤溶酶的药效学实验 | 第26-27页 |
| ·豆豉纤溶酶基因的克隆和外源表达 | 第27-29页 |
| ·豆豉纤溶酶的分子改造 | 第29页 |
| ·酶的定向进化 | 第29-40页 |
| ·定向进化中常用随机突变的方法 | 第30-37页 |
| ·突变体文库的筛选 | 第37-38页 |
| ·定向进化在酶改造中的应用 | 第38-40页 |
| ·选题背景及研究内容 | 第40-42页 |
| 第二章 豆豉纤溶酶基因的获取与验证 | 第42-63页 |
| ·实验材料 | 第42-46页 |
| ·菌株与质粒 | 第42-43页 |
| ·工具酶、试剂盒、抗生素及其它生化试剂 | 第43-44页 |
| ·培养基的配制 | 第44页 |
| ·常用试剂的配制 | 第44-45页 |
| ·主要仪器与设备 | 第45-46页 |
| ·实验方法 | 第46-54页 |
| ·豆豉纤溶酶基因的克隆及同源性分析 | 第46-48页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第48-51页 |
| ·重组表达菌株的诱导表达 | 第51页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第51-53页 |
| ·纤溶酶活力的测定 | 第53页 |
| ·豆豉纤溶酶的纯化 | 第53-54页 |
| ·豆豉纤溶酶的N-端序列测定 | 第54页 |
| ·结果与分析 | 第54-60页 |
| ·枯草芽孢杆菌DC-12 基因组提取 | 第54-55页 |
| ·豆豉纤溶酶基因的克隆及同源性分析 | 第55-57页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第57页 |
| ·豆豉纤溶酶基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第57-59页 |
| ·豆豉纤溶酶的纯化 | 第59-60页 |
| ·豆豉纤溶酶的N-末端序列测定 | 第60页 |
| ·讨论 | 第60-62页 |
| ·本章小结 | 第62-63页 |
| 第三章 豆豉纤溶酶基因的体外随机诱变与定向选择 | 第63-84页 |
| ·实验材料 | 第63-64页 |
| ·菌株与质粒 | 第63页 |
| ·工具酶、试剂盒、抗生素，纯化柱及其它生化试剂 | 第63-64页 |
| ·培养基 | 第64页 |
| ·琼脂糖电泳和SDS-PAGE 电泳相关溶液 | 第64页 |
| ·其它试剂配制 | 第64页 |
| ·主要仪器设备 | 第64页 |
| ·实验方法 | 第64-70页 |
| ·易错PCR 条件的优化 | 第64-65页 |
| ·随机突变文库的构建和筛选 | 第65-68页 |
| ·豆豉纤溶酶及其突变酶的纯化 | 第68页 |
| ·豆豉纤溶酶及其突变酶动力学参数的测定 | 第68页 |
| ·豆豉纤溶酶两种酶活力测定方法的比较 | 第68-69页 |
| ·豆豉纤溶酶及其突变酶的酶学性质 | 第69页 |
| ·突变酶的结构预测和突变位点分析 | 第69-70页 |
| ·结果与分析 | 第70-81页 |
| ·易错PCR 条件的优化 | 第70-71页 |
| ·随机突变文库的构建和筛选 | 第71-73页 |
| ·突变酶mDFE3 基因的测序结果分析 | 第73-74页 |
| ·两种豆豉纤溶酶酶活力测定方法的比较 | 第74-75页 |
| ·豆豉纤溶酶及其突变酶的基本酶学性质 | 第75-79页 |
| ·突变酶的结构预测和突变位点分析 | 第79-81页 |
| ·讨论 | 第81-83页 |
| ·易错PCR 条件的选择 | 第81-82页 |
| ·筛选方法的初步建立 | 第82页 |
| ·突变酶的突变位点分析 | 第82-83页 |
| ·本章小结 | 第83-84页 |
| 第四章 突变酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第84-101页 |
| ·材料与方法 | 第85-87页 |
| ·菌株与质粒 | 第85-86页 |
| ·酶和试剂 | 第86-87页 |
| ·培养基 | 第87页 |
| ·主要仪器设备 | 第87页 |
| ·实验方法 | 第87-93页 |
| ·突变酶重组表达质粒的构建方案 | 第87-89页 |
| ·带有卡那霉素抗性基因的质粒pHK11 的构建 | 第89-90页 |
| ·突变酶基因重组表达质粒的构建 | 第90-91页 |
| ·突变酶基因重组菌的获得 | 第91页 |
| ·突变酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达 | 第91-92页 |
| ·豆豉纤溶酶活力测定 | 第92页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第92页 |
| ·突变酶基因重组表达质粒的稳定性 | 第92-93页 |
| ·结果与分析 | 第93-98页 |
| ·质粒pHK11 的构建与鉴定 | 第93-94页 |
| ·重组表达载体的构建与鉴定 | 第94-95页 |
| ·突变酶基因重组菌的诱导表达 | 第95-97页 |
| ·重组质粒的稳定性 | 第97-98页 |
| ·讨论 | 第98-100页 |
| ·突变酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第98-99页 |
| ·重组质粒的稳定性 | 第99-100页 |
| ·本章小结 | 第100-101页 |
| 第五章 突变酶基因重组菌的发酵条件优化 | 第101-111页 |
| ·实验材料 | 第101页 |
| ·菌种 | 第101页 |
| ·培养基 | 第101页 |
| ·主要试剂 | 第101页 |
| ·实验仪器 | 第101页 |
| ·实验方法 | 第101-102页 |
| ·培养及诱导方法 | 第101-102页 |
| ·细胞含量的测定 | 第102页 |
| ·纤溶酶活力测定 | 第102页 |
| ·结果与讨论 | 第102-110页 |
| ·碳源的选择 | 第102-103页 |
| ·氮源的选择 | 第103-104页 |
| ·无机盐对发酵产酶的影响 | 第104-105页 |
| ·发酵条件的优化 | 第105-109页 |
| ·优化后的突变酶重组菌发酵 | 第109-110页 |
| ·本章小结 | 第110-111页 |
| 结论与展望 | 第111-113页 |
| 参考文献 | 第113-129页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
| 附录 | 第131页 |
