| 目录 | 第1-10页 |
| 中文摘要 | 第10-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 符号说明 | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-33页 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 | 第18-27页 |
| ·PRRSV概述 | 第18页 |
| ·PRRSV病原学特性 | 第18-19页 |
| ·病毒基因组结构 | 第19-20页 |
| ·PRRSV主要编码蛋白 | 第20-21页 |
| ·非结构蛋白 | 第20页 |
| ·结构蛋白 | 第20-21页 |
| ·PRRSV免疫学研究进展 | 第21-23页 |
| ·体液免疫 | 第22-23页 |
| ·细胞免疫 | 第23页 |
| ·PRRSV诊断方法研究进展 | 第23-25页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原检测技术 | 第23-25页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测技术 | 第25页 |
| ·PRRSV的疫苗与防治 | 第25-27页 |
| ·灭活苗 | 第26页 |
| ·PRRS弱毒疫苗 | 第26页 |
| ·基因工程疫苗 | 第26-27页 |
| 2 前胸腺素研究进展 | 第27-31页 |
| ·前胸腺素概述 | 第27页 |
| ·ProTα的结构特点 | 第27-28页 |
| ·ProTα的生物学活性 | 第28-31页 |
| 3 本研究的目的与意义 | 第31-33页 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒SCMS08株分离鉴定 | 第33-52页 |
| 1 材料与方法 | 第33-41页 |
| ·实验材料 | 第33-34页 |
| ·病料来源 | 第33页 |
| ·细胞、菌株及载体 | 第33-34页 |
| ·主要试剂 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34页 |
| ·实验方法 | 第34-41页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·病料的采集与处理 | 第34页 |
| ·病毒分离与传代 | 第34-35页 |
| ·间接免疫荧光试验 | 第35页 |
| ·外源病毒的检测 | 第35-36页 |
| ·病毒细胞半数感染量(TCID_(50))的测定 | 第36-37页 |
| ·病毒理化试验 | 第37页 |
| ·电镜观察 | 第37页 |
| ·Nsp2和GP5基因的克隆 | 第37-41页 |
| ·动物回归实验及病理学观察 | 第41页 |
| 2 结果 | 第41-49页 |
| ·病毒分离 | 第41-42页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第42页 |
| ·分离病毒纯度检测 | 第42-43页 |
| ·病毒滴度测定 | 第43-44页 |
| ·病毒理化试验 | 第44页 |
| ·病毒核酸类型鉴定 | 第44页 |
| ·氯仿敏感试验 | 第44页 |
| ·耐热性试验 | 第44页 |
| ·电镜观察 | 第44-45页 |
| ·RT-PCR扩增和鉴定 | 第45-46页 |
| ·Nsp2基因序列测定与序列分析 | 第46-47页 |
| ·GP5基因的序列测定 | 第47-48页 |
| ·动物回归实验 | 第48-49页 |
| ·主要实质器官病理学观察 | 第49页 |
| 3 讨论 | 第49-51页 |
| ·关于病毒分离鉴定 | 第49-50页 |
| ·关于毒力变异 | 第50-51页 |
| 4 小结 | 第51-52页 |
| 第三章 对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立及四川PRRSV遗传进化分析 | 第52-70页 |
| 1 材料与方法 | 第52-57页 |
| ·材料 | 第52-53页 |
| ·病毒、菌株及载体 | 第52-53页 |
| ·病料来源 | 第53页 |
| ·试剂 | 第53页 |
| ·主要仪器 | 第53页 |
| ·方法 | 第53-57页 |
| ·检测引物设计 | 第53页 |
| ·病料的采集与处理 | 第53-54页 |
| ·病毒RNA的提取和反转录cDNA的合成 | 第54页 |
| ·单项PCR反应体系的建立及优化 | 第54-55页 |
| ·RT-PCR产物的鉴定 | 第55页 |
| ·多重PCR反应体系的建立及条件优化 | 第55页 |
| ·名重RT-PCR的特异性试验 | 第55页 |
| ·多重RT-PCR敏感性试验 | 第55-56页 |
| ·临床样品的检测 | 第56页 |
| ·遗传进化分析研究 | 第56-57页 |
| 2 结果 | 第57-66页 |
| ·单项PCR反应体系的建立 | 第57-59页 |
| ·RT-PCR产物的鉴定 | 第59页 |
| ·多重RT-PCR的建立和条件优化 | 第59页 |
| ·多重RT-PCR的特异性试验 | 第59-60页 |
| ·敏感性试验 | 第60-61页 |
| ·临床样品的检测结果 | 第61页 |
| ·遗传进化分析 | 第61-66页 |
| ·Nsp2高变区域的扩增及序列测定 | 第61-62页 |
| ·Nsp2序列分析结果 | 第62-66页 |
| 3 讨论 | 第66-68页 |
| ·关于多重RT-PCR方法 | 第66-68页 |
| ·遗传进化分析 | 第68页 |
| 4 小结 | 第68-70页 |
| 第四章 PRRSV NSP2高变区主要抗原表位鉴定及间接ELISA方法的建立 | 第70-94页 |
| 1 材料与方法 | 第70-78页 |
| ·实验材料 | 第70-71页 |
| ·细胞和菌株 | 第70-71页 |
| ·主要试剂 | 第71页 |
| ·血清检测样品的采集与处理 | 第71页 |
| ·主要仪器 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71-78页 |
| ·Nsp2基因编码产物的结构预测及抗原性分析 | 第71-72页 |
| ·引物设计和合成 | 第72页 |
| ·Nsp2分段表达载体的构建 | 第72-74页 |
| ·重组表达质粒的诱导表达 | 第74-76页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第76-77页 |
| ·Nsp2 ELISA抗体检测方法的建立 | 第77-78页 |
| 2 实验结果 | 第78-91页 |
| ·Nsp2基因高变区的结构预测分析 | 第78-80页 |
| ·Nsp2基因高变区的跨膜区预测 | 第78-79页 |
| ·Nsp2基因编码产物的N糖基化位点预测 | 第79页 |
| ·Nsp2高变区二级结构分析 | 第79-80页 |
| ·Nsp2基因编码产物的抗原性分析 | 第80-83页 |
| ·Nsp2分段表达载体的构建和鉴定 | 第83-85页 |
| ·Nsp2主要抗原区域基因片断的克隆 | 第83-84页 |
| ·表达载体的构建及鉴定 | 第84-85页 |
| ·表达产物的表达 | 第85-88页 |
| ·包被抗原蛋白浓度测定 | 第88页 |
| ·抗原和抗体最佳浓度的确定 | 第88-90页 |
| ·间接ELISA方法阴性阳性临界值的确定 | 第90-91页 |
| ·特异性实验 | 第91页 |
| ·阳性血清检测结果 | 第91页 |
| 3 讨论 | 第91-93页 |
| ·关于Nsp2抗原位点 | 第91-93页 |
| ·关于原核表达 | 第93页 |
| 4 小结 | 第93-94页 |
| 第五章 猪前胸腺素的分子克隆及生物学功能初步研究 | 第94-110页 |
| 1 材料与方法 | 第94-100页 |
| ·实验材料 | 第94-95页 |
| ·载体、菌株及实验动物 | 第94页 |
| ·主要试剂 | 第94-95页 |
| ·主要仪器 | 第95页 |
| ·生物信息学相关软件与资源 | 第95页 |
| ·方法 | 第95-100页 |
| ·引物设计与合成 | 第95页 |
| ·RNA的提取 | 第95-96页 |
| ·ProTa基因的RT-PCR体外扩增 | 第96页 |
| ·猪ProTa基因TA克隆与序列分析 | 第96页 |
| ·猪ProTa原核表达研究 | 第96-98页 |
| ·pEGFP-ProTa真核表达载体在Vero细胞中瞬时表达研究 | 第98-100页 |
| 2 结果 | 第100-107页 |
| ·猪ProTa基因的RT-PCR扩增及测序结果分析 | 第100-101页 |
| ·猪ProTa基因核苷酸、氨基酸组成及进化树分析 | 第101-102页 |
| ·猪ProTa基因编码产物结构预测 | 第102-104页 |
| ·重组表达载体pET-mProTa的构建及鉴定 | 第104-105页 |
| ·猪ProTa融合蛋白的原核表达及纯化SDS-PAGE电泳检测 | 第105页 |
| ·原核表达产物的western blot | 第105页 |
| ·表达产物生物活性的检测 | 第105-106页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第106-107页 |
| ·在Vero细胞中的表达 | 第107页 |
| 3 讨论 | 第107-109页 |
| ·关于猪ProTa结构与功能 | 第107-108页 |
| ·关于猪ProTa表达研究 | 第108-109页 |
| 4 小结 | 第109-110页 |
| 第六章 减毒沙门氏菌介导的PRRSV GP5-PRoTA二联基因疫苗的免疫学研究 | 第110-136页 |
| 1 材料和方法 | 第110-118页 |
| ·实验材料 | 第110-111页 |
| ·载体、菌株及实验动物 | 第110-111页 |
| ·主要试剂 | 第111页 |
| ·主要仪器 | 第111页 |
| ·实验方法 | 第111-118页 |
| ·引物的设计与合成 | 第111-112页 |
| ·GP5主要抗原表位原核表达研究 | 第112-113页 |
| ·真核载体的构建 | 第113页 |
| ·重组真核表达载体在Vero细胞中的瞬时表达研究 | 第113-114页 |
| ·猪ProTa基因的免疫佐剂作用研究 | 第114-116页 |
| ·重组减毒沙门氏菌的构建及生物特性研究 | 第116-117页 |
| ·携质粒S.C500口服免疫BALB/c小鼠免疫研究 | 第117-118页 |
| ·统计学分析 | 第118页 |
| 2 实验结果 | 第118-132页 |
| ·PRRSV GP5主要抗原表位研究 | 第118-123页 |
| ·PRRSV GP5基因的序列分析 | 第118-121页 |
| ·克隆质粒pMD-mGP5的构建 | 第121-122页 |
| ·原核表达载体pET-mGP5的构建 | 第122-123页 |
| ·pET-mGP5表达产物的SDS-PAGE和western blot分析 | 第123页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第123-125页 |
| ·表达目的基因片段的克隆 | 第123-124页 |
| ·串联融合表达基因的连接 | 第124-125页 |
| ·pCI-GP5-ProTa、pCI-GP5、pCI-ProTa真核表达载体的构建 | 第125页 |
| ·pCI-GP5-ProTa在Vero细胞中的表达 | 第125-126页 |
| ·RT-PCR转录检测 | 第125-126页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第126页 |
| ·猪ProTα基因的免疫佐剂作用研究 | 第126-129页 |
| ·免疫小鼠血清GP5中和抗体的检测结果 | 第126-127页 |
| ·脾细胞增殖实验检测结果 | 第127页 |
| ·脾脏T细胞亚群的检测 | 第127-128页 |
| ·IL-4和IFN-γ检测结果 | 第128-129页 |
| ·减毒沙门氏菌疫苗研究 | 第129-132页 |
| ·重组表达质粒转化减毒沙门氏菌的结果 | 第129页 |
| ·重组工程菌体外培养特性检测 | 第129-130页 |
| ·S.C500体外培养中质粒的稳定性 | 第130-131页 |
| ·重组减毒沙门氏菌体内稳定性 | 第131页 |
| ·重组菌的安全性 | 第131页 |
| ·GP5特异的血清及黏膜抗体测定结果 | 第131-132页 |
| ·淋巴细胞增殖试验结果 | 第132页 |
| 3 讨论 | 第132-134页 |
| ·关于GP5原核表达 | 第132-133页 |
| ·关于ProTa免疫佐剂的研究 | 第133-134页 |
| ·关于携带pCI-GP5-ProTa真核表达质粒减毒沙门氏菌 | 第134页 |
| 4 小结 | 第134-136页 |
| 全文总结论 | 第136-138页 |
| 本研究的创新点 | 第138-139页 |
| 本研究的展望与建议 | 第139-140页 |
| 参考文献 | 第140-157页 |
| 致谢 | 第157-158页 |
| 个人简介 | 第158-159页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第159页 |
