| 致谢 | 第4-8页 |
| 英文缩略表 | 第8-9页 |
| 摘要 | 第9-10页 |
| 1.文献综述 | 第10-22页 |
| 1.1 天然免疫概述 | 第10页 |
| 1.2 天然免疫系统识别病原分子 | 第10-15页 |
| 1.2.1 Toll样受体家族 | 第11-12页 |
| 1.2.2 DNA识别受体家族 | 第12-14页 |
| 1.2.3 RNA识别受体家族 | 第14-15页 |
| 1.2.4 其他的PRRs | 第15页 |
| 1.3 STING的发现及临床意义 | 第15-17页 |
| 1.3.1 STING的结构 | 第15页 |
| 1.3.2 STING的抗病毒机制 | 第15-16页 |
| 1.3.3 STING与G10 | 第16-17页 |
| 1.4 干扰素的简介 | 第17-18页 |
| 1.4.1 干扰素的分类 | 第17页 |
| 1.4.2 干扰素抗病毒的作用机制 | 第17-18页 |
| 1.4.3 干扰素刺激因子 | 第18页 |
| 1.5 伪狂犬病 | 第18-19页 |
| 1.5.1 伪狂犬病 | 第18页 |
| 1.5.2 PRV的生物学特性 | 第18-19页 |
| 1.5.3 PRV与DNA识别受体 | 第19页 |
| 1.6 CRISPR/Cas9的研究进展 | 第19-21页 |
| 1.6.1 CRISPR/Cas9的结构及原理 | 第19-20页 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas9的优势及局限 | 第20-21页 |
| 1.7 展望 | 第21-22页 |
| 2.引言 | 第22-23页 |
| 3.材料与方法 | 第23-36页 |
| 3.1 材料 | 第23-25页 |
| 3.1.1 细胞和病毒 | 第23页 |
| 3.1.2 细胞培养耗材 | 第23页 |
| 3.1.3 感受态和质粒 | 第23页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 3.1.5 主要试剂 | 第24页 |
| 3.1.6 常规生化试剂的配制 | 第24-25页 |
| 3.2 试验方法 | 第25-36页 |
| 3.2.1 E.coli Top10感受态的制备 | 第25页 |
| 3.2.2 引物设计与合成 | 第25-27页 |
| 3.2.2.1 sgRNA引物设计与合成 | 第25-26页 |
| 3.2.2.2 PCR克隆引物设计与合成 | 第26-27页 |
| 3.2.2.3 Q-PCR克隆引物设计与合成 | 第27页 |
| 3.2.3 pSTING-sgRNA载体构建 | 第27-29页 |
| 3.2.3.1 sgRNA引物退火 | 第27-28页 |
| 3.2.3.2 质粒酶切与回收 | 第28页 |
| 3.2.3.3 重组质粒的连接与转化 | 第28-29页 |
| 3.2.3.4 质粒提取 | 第29页 |
| 3.2.4 3D4/21-STING~(-/-)多克隆细胞系构建 | 第29-32页 |
| 3.2.4.1 STING-sgRNA慢病毒的包装 | 第29-30页 |
| 3.2.4.2 感染细胞筛选细胞系 | 第30页 |
| 3.2.4.3 细胞基因组提取 | 第30页 |
| 3.2.4.4 PCR扩增及切胶纯化 | 第30-31页 |
| 3.2.4.5 T7酶切检测 | 第31-32页 |
| 3.2.5 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的筛选 | 第32页 |
| 3.2.6 酶标仪检测 | 第32-33页 |
| 3.2.7 荧光观察及流式检测 | 第33页 |
| 3.2.8 PRV病毒滴度的测定 | 第33-34页 |
| 3.2.8.1 病毒的扩增和收取 | 第33-34页 |
| 3.2.8.2 病毒滴度的测定 | 第34页 |
| 3.2.9 实时荧光定量PCR | 第34-36页 |
| 3.2.9.1 细胞总RNA的提取 | 第34-35页 |
| 3.2.9.2 反转录合成cDNA | 第35页 |
| 3.2.9.3 荧光定量PCR检测 | 第35-36页 |
| 3.2.9.4 mRNA相对表达量的计算 | 第36页 |
| 3.2.10 数据处理 | 第36页 |
| 4.结果与分析 | 第36-44页 |
| 4.1 猪STING-sgRNA重组质粒的构建及鉴定 | 第36-38页 |
| 4.1.1 52961质粒酶切结果 | 第36-37页 |
| 4.1.2 质粒测序结果 | 第37-38页 |
| 4.2 3D4/21-STING~(-/-)多克隆细胞系的构建 | 第38-39页 |
| 4.2.1 STING基因编辑效率的检测 | 第38页 |
| 4.2.2 T7酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 4.3 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的筛选 | 第39页 |
| 4.4 G10抑制PRV-GFP在3D4/21-WT细胞中的复制 | 第39-40页 |
| 4.5 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的鉴定 | 第40-44页 |
| 4.5.1 STING基因敲除对PRV-GFP病毒复制的影响 | 第40-42页 |
| 4.5.2 STING基因敲除对PRV-GFP和PRV-QXX病毒滴度的影响 | 第42-43页 |
| 4.5.3 STING基因敲除对ISG基因的影响 | 第43-44页 |
| 5.讨论与结论 | 第44-46页 |
| 5.1 讨论 | 第44-45页 |
| 5.2 结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-55页 |
| 英文摘要 | 第55-56页 |
