| 摘要 | 第5-9页 |
| abstract | 第9-14页 |
| 第一章 绪论 | 第18-23页 |
| 1.1 研究背景 | 第18-21页 |
| 1.1.1 PD-1/PD-L1与肿瘤免疫逃逸 | 第18-19页 |
| 1.1.2 国内外PD-1/PD-L1研发现状 | 第19-20页 |
| 1.1.3 单域抗体 | 第20-21页 |
| 1.2 研究目的及意义 | 第21页 |
| 1.3 研究方法 | 第21-22页 |
| 1.4 论文结构安排 | 第22页 |
| 1.5 研究路线 | 第22-23页 |
| 第二章 抗PD-1配体结合界面区单域抗体的筛选 | 第23-36页 |
| 2.1 前言 | 第23-24页 |
| 2.1.1 载体噬菌体 | 第23-24页 |
| 2.1.2 辅助噬菌体 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.2.1 试验仪器主要仪器 | 第24页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第24-25页 |
| 2.2.3 培养基与试液的配制 | 第25-26页 |
| 2.3 试验方法 | 第26-29页 |
| 2.3.1 抗原配体的获取 | 第26页 |
| 2.3.2 单域抗体的筛选 | 第26-27页 |
| 2.3.3 单域抗体噬菌体库的扩增 | 第27页 |
| 2.3.4 辅助噬菌体KM13的准备(扩增、纯化) | 第27-28页 |
| 2.3.5 单域抗体噬菌体库/重组噬菌体的扩增、纯化、淘洗 | 第28-29页 |
| 2.3.6 单克隆噬菌体ELISA检测阳性克隆 | 第29页 |
| 2.4 试验结果与分析 | 第29-35页 |
| 2.4.1 抗原配体的获取 | 第29-30页 |
| 2.4.2 单域抗体的筛选结果分析 | 第30-33页 |
| 2.4.3 ELISA检测阳性克隆 | 第33页 |
| 2.4.4 阳性克隆的测序结果 | 第33-35页 |
| 2.5 讨论与小结 | 第35-36页 |
| 第三章 Nb:PD-1真核表达系统的构建与表达 | 第36-55页 |
| 3.1 前言 | 第36页 |
| 3.2 试验材料 | 第36-39页 |
| 3.2.1 菌种 | 第36页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第36-37页 |
| 3.2.3 实验仪器 | 第37页 |
| 3.2.4 培养基与缓冲液配制 | 第37-39页 |
| 3.2.5 其他仪器与用具 | 第39页 |
| 3.3 试验方法 | 第39-45页 |
| 3.3.1 靶向PD-1配体结合界面的单域抗体氨基酸序列优化 | 第39页 |
| 3.3.2 Nb:PD-1目的基因设计与合成 | 第39-40页 |
| 3.3.3 Nb:PD-1-pGAPZα-A的构建 | 第40-42页 |
| 3.3.4 毕赤酵母X-33-Nb:PD-1重组工程菌的构建 | 第42-43页 |
| 3.3.5 Nb:PD-1蛋白的纯化及糖基化验证 | 第43-45页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第45-54页 |
| 3.4.1 氨基酸序列优化结果 | 第45-46页 |
| 3.4.2 目的基因设计与合成结果 | 第46-49页 |
| 3.4.3 Nb:PD-1的毕赤酵母X-33工程菌的筛选与产物表达 | 第49-52页 |
| 3.4.4 Nb:PD-1的纯化与糖基化验证 | 第52-54页 |
| 3.5 讨论与小结 | 第54-55页 |
| 第四章 Nb:PD-1原核表达系统的构建与表达 | 第55-67页 |
| 4.1 前言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第55页 |
| 4.2.2 主要材料和试剂 | 第55-56页 |
| 4.2.3 试验仪器 | 第56页 |
| 4.2.4 培养基与缓冲液 | 第56页 |
| 4.3 试验方法 | 第56-59页 |
| 4.3.1 Nb:PD-1目的基因的设计与合成 | 第56-57页 |
| 4.3.2 载体质粒pET21b-Nb:PD-1的构建 | 第57-58页 |
| 4.3.3 E.coliBL21(DE3)-Nb:PD-1工程菌的构建 | 第58页 |
| 4.3.4 E.coliBL21(DE3)-pET21b-Nb:PD-1的可溶性表达 | 第58-59页 |
| 4.4 结果 | 第59-66页 |
| 4.4.1 Nb:PD-1基因大肠杆菌偏爱密码子优化与扩增 | 第59-60页 |
| 4.4.2 目的基因与表达载体双酶切及其胶回收 | 第60-61页 |
| 4.4.3 重组质粒pET21b-hTGF-β1的构建与转化 | 第61-63页 |
| 4.4.4 高表达菌株的筛选 | 第63-64页 |
| 4.4.5 可溶性表达 | 第64-66页 |
| 4.5 讨论与小结 | 第66-67页 |
| 第五章 亲和力常数测定与活性检测 | 第67-74页 |
| 5.1 前言 | 第67页 |
| 5.2 试验材料 | 第67-68页 |
| 5.2.1 细胞株 | 第67页 |
| 5.2.2 主要仪器 | 第67-68页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第68页 |
| 5.3 试验方法 | 第68-70页 |
| 5.3.1 亲和力常数测定 | 第68-69页 |
| 5.3.2 抗PD-1单域抗体的结合活性分析 | 第69-70页 |
| 5.4 试验结果 | 第70-73页 |
| 5.4.1 亲和力常数测定结果 | 第70-71页 |
| 5.4.2 抗PD-1单域抗体的结合活性分析结果 | 第71-73页 |
| 5.5 讨论与小结 | 第73-74页 |
| 第六章 结论与展望 | 第74-75页 |
| 6.1 结论 | 第74页 |
| 6.2 展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
