| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 引言 | 第13-17页 |
| 1 实验材料 | 第17-21页 |
| 1.1 酶制品和分子量 Marker | 第17页 |
| 1.2. 主要生化试剂 | 第17页 |
| 1.3. 培养基、血清及抗生素 | 第17-18页 |
| 1.4. 细胞因子和生长因子 | 第18页 |
| 1.5. 试剂盒 | 第18页 |
| 1.6. 菌株 | 第18页 |
| 1.7. 质粒 | 第18页 |
| 1.8. 细胞系 | 第18页 |
| 1.9. 人脐带血标本 | 第18-19页 |
| 1.10. 生物信息学分析软件 | 第19页 |
| 1.11. 主要仪器及设备 | 第19-21页 |
| 2 实验方法 | 第21-39页 |
| 2.1. 细胞学实验 | 第21-22页 |
| 2.1.1 细胞系的培养 | 第21页 |
| 2.1.2 细胞系的诱导 | 第21页 |
| 2.1.3 细胞系的转染 | 第21-22页 |
| 2.2. 造血干细胞的体外培养 | 第22-23页 |
| 2.2.1 人脐带血标本的收集 | 第22页 |
| 2.2.2 单个核细胞的分离和纯化 | 第22-23页 |
| 2.2.3 CD34+造血干/祖细胞体外诱导红系分化 | 第23页 |
| 2.2.4 流式细胞术(FACS)检测细胞表面分化 maker | 第23页 |
| 2.3. Real‐time PCR | 第23-25页 |
| 2.3.1 TRIZOl 法提取细胞总 RNA | 第23-24页 |
| 2.3.2 RNA 质量的检测 | 第24页 |
| 2.3.3 M-MLV 合成 cDNA 第一链 | 第24-25页 |
| 2.4. 重组质粒的构建 | 第25页 |
| 2.5. 质粒 DNA 的提取 | 第25-26页 |
| 2.5.1 质粒 DNA 的小量提取和定量 | 第25-26页 |
| 2.6. 质粒 DNA 的大量制备及纯化 | 第26-27页 |
| 2.7. 慢病毒的包装 | 第27页 |
| 2.7.1 慢病毒的包装和收获 | 第27页 |
| 2.7.2 慢病毒的浓缩 | 第27页 |
| 2.7.3 慢病毒感染目的细胞 | 第27页 |
| 2.8. Western blot | 第27-29页 |
| 2.8.1 蛋白的提取及定量 | 第27-28页 |
| 2.8.2 蛋白的 SDS-PAGE 电泳 | 第28页 |
| 2.8.3 蛋白电转移 | 第28页 |
| 2.8.4 杂交 | 第28页 |
| 2.8.5 二次免疫印迹 | 第28-29页 |
| 2.9. 双萤光报告实验 | 第29页 |
| 2.10. RNA –EMSA 实验 | 第29-30页 |
| 2.10.1 样品的制备 | 第29页 |
| 2.10.2 制备-PAGE 电泳 | 第29页 |
| 2.10.3 蛋白的电转移 | 第29-30页 |
| 2.10.4 紫外交联 | 第30页 |
| 2.10.5 杂交 | 第30页 |
| 2.11. RNA‐IP(RNA Binding protein immunoprecipitation) 实验 | 第30-32页 |
| 2.11.1 制备抗体包被的 protein A | 第30页 |
| 2.11.2 裂解细胞 | 第30-32页 |
| 2.12. MS2‐MBP 实验 | 第32-33页 |
| 2.13. 5，‐race 实验 | 第33-36页 |
| 2.13.1 磷酸化处理 | 第33页 |
| 2.13.2 “去帽子”反应-使用 Tobacco Acid pyrophospharase（TAP）去掉 m RNA 的 5，帽子，保留一个磷酸集团 | 第33-34页 |
| 2.13.3 5，-Race Adapter 连接 | 第34页 |
| 2.13.4 反转录反应，按下列体系加入： | 第34-35页 |
| 2.13.5 outer PCR 反应 | 第35页 |
| 2.13.6 inner PCR 反应 | 第35-36页 |
| 2.14. 3,-Race 实验 | 第36-37页 |
| 2.14.1 反转录反应，体系如下： | 第36页 |
| 2.14.2 套式 PCR 反应 | 第36-37页 |
| 2.14.3 inner PCR 反应 | 第37页 |
| 2.15 统计学分析 | 第37-39页 |
| 3 实验结果 | 第39-51页 |
| 3.1. 红系分化中 miRNA 的表达检测 | 第39-43页 |
| 3.1.1 MiR-918 与红系分化相关 | 第39-40页 |
| 3.1.2 pri-918 全长转录本的获得 | 第40页 |
| 3.1.3 QKI-5 促进 miR-918 的加工 | 第40-41页 |
| 3.1.4 RNA‐IP 实验验证 QKI‐5 和 miR‐918 的结合 | 第41-42页 |
| 3.1.5 RNA‐EMSA 实验验证 QKI‐5 和 miR‐918 的直接结合 | 第42-43页 |
| 3.1.6 MS2-MBP 实验验证 QKI-5 和 miR-918 的结合 | 第43页 |
| 3.2. miR‐918 在红系分化过程中的功能研究 | 第43-47页 |
| 3.2.1 miR-918 基因结构分析 | 第43-44页 |
| 3.2.2 miR-918 在红系分化中的表达 | 第44-45页 |
| 3.2.2.1 hemin 诱导 K562 细胞向红系分化 | 第44页 |
| 3.2.2.2 定向诱导 CD34+向红系分化 | 第44-45页 |
| 3.2.3 miR‐918 在红系分化中的功能 | 第45-47页 |
| 3.2.3.1 过表达 miR-918 对 K562 的影响 | 第45-46页 |
| 3.2.3.2 过表达 miR-918 对 CD34+造血干细胞分化的影响 | 第46-47页 |
| 3.3. QKI‐5 在红系分化中的功能研究 | 第47-48页 |
| 3.3.1 QKI-5 在 K562 红系分化中的功能 | 第47-48页 |
| 3.4. miR‐918 作用于红系分化的分子机制研究 | 第48-51页 |
| 3.4.1 miR-918 靶基因的预测和初步验证 | 第48-49页 |
| 3.4.2 miR-918 靶基因的突变位点分析 | 第49页 |
| 3.4.3 miR-918 靶基因的 western blot 验证 | 第49-51页 |
| 4 结论 | 第51-53页 |
| 5 讨论 | 第53-57页 |
| 5.1 在细胞核中 miRNA 的生物起源和加工过程 | 第53-54页 |
| 5.2 miRNAs 在细胞质的加工过程 | 第54页 |
| 5.3 红系分化中重要的转录因子 | 第54-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 文献综述 | 第63-75页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 攻读硕士期间发表和待发表的学术论文 | 第76-77页 |
