| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 引言 | 第18-30页 |
| 1.1 乙型脑炎病毒概述 | 第18-19页 |
| 1.2 JEV基因组结构及编码蛋白功能 | 第19-22页 |
| 1.3 嵌合病毒的构建在乙型脑炎病毒毒力相关因子研究上的应用 | 第22-23页 |
| 1.4 有关乙型脑炎病毒毒力差异位点的研究进展 | 第23页 |
| 1.5 乙型脑炎病毒减毒机制研究现状 | 第23-29页 |
| 1.6 本研究目的与意义 | 第29-30页 |
| 第二章 JEV CDNA克隆在宿主菌中不稳定因子的研究 | 第30-48页 |
| 2.1 材料与方法 | 第30-39页 |
| 2.1.1 菌株、毒株、细胞、重组质粒 | 第30页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.3 引物设计与合成 | 第31-32页 |
| 2.1.4 菌株与培养温度对cDNA稳定性的影响 | 第32页 |
| 2.1.5 寻找JEV基因组中可能具有原核启动子活性的序列区段 | 第32页 |
| 2.1.6 PCR产物和酶切后产物胶回收 | 第32页 |
| 2.1.7 质粒构建 | 第32-35页 |
| 2.1.8 RNA二级结构预测 | 第35页 |
| 2.1.9 定点突变 2913-nt cDNA | 第35-36页 |
| 2.1.10 cDNA克隆在大肠杆菌中稳定性分析 | 第36页 |
| 2.1.11 原核启动子活性分析 | 第36-39页 |
| 2.1.12 Western Blot | 第39页 |
| 2.1.13 统计学分析 | 第39页 |
| 2.2 结果 | 第39-46页 |
| 2.2.1 宿主菌株对JEV cDNA克隆稳定性的影响 | 第39-40页 |
| 2.2.2 培养温度影响JEV cDNA克隆稳定性 | 第40-41页 |
| 2.2.3 JEV cDNA突变的特征 | 第41-42页 |
| 2.2.4 E基因部分截断对JEV cDNA克隆稳定性的影响 | 第42页 |
| 2.2.5 病毒ORF中的起始密码子影响 2913-nt cDNA克隆的稳定性 | 第42页 |
| 2.2.6 将JEV 5’ 端截短的重组质粒在大肠杆菌中的稳定性 | 第42-43页 |
| 2.2.7 JEV序列nt 54-120具有原核启动子活性 | 第43-44页 |
| 2.2.8 在nt 90处的突变不能稳定JEV cDNA克隆 | 第44-45页 |
| 2.2.9 室温培养降低JEV基因组中原核启动子的启动子活性 | 第45-46页 |
| 2.3 讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 JEV弱毒株HEN-10S3反向遗传操作平台的建立 | 第48-64页 |
| 3.1 材料与方法 | 第48-59页 |
| 3.1.1 病毒、细胞、质粒 | 第48页 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 | 第48页 |
| 3.1.3 分段克隆 | 第48-53页 |
| 3.1.4 pCR定点突变 | 第53页 |
| 3.1.5 全长拼接 | 第53-55页 |
| 3.1.6 重组病毒的拯救 | 第55-56页 |
| 3.1.7 RNA提取 | 第56-57页 |
| 3.1.8 反转录多聚酶链反应（RT-PCR）和PCR产物的酶切鉴定 | 第57-58页 |
| 3.1.9 间接免疫荧光 | 第58页 |
| 3.1.10 病毒生长曲线的绘制 | 第58-59页 |
| 3.1.11 空斑形成试验 | 第59页 |
| 3.1.12 小鼠毒力测试 | 第59页 |
| 3.2 结果 | 第59-62页 |
| 3.2.1 JEV全长cDNA克隆pBAHC的构建及病毒的拯救 | 第59-60页 |
| 3.2.2 被拯救病毒vAHEN的鉴定 | 第60-61页 |
| 3.2.3 被拯救病毒vAHEN的生长特性分析 | 第61-62页 |
| 3.2.4 被拯救病毒vAHEN毒力测试 | 第62页 |
| 3.3 讨论 | 第62-64页 |
| 第四章 JEV强、弱毒株嵌合病毒的构建及其毒力分析 | 第64-73页 |
| 4.1 材料与方法 | 第64-67页 |
| 4.1.1 病毒、细胞、质粒 | 第64页 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 | 第64页 |
| 4.1.3 核苷酸序列分析 | 第64-65页 |
| 4.1.4 嵌合克隆的构建 | 第65-66页 |
| 4.1.5 嵌合病毒的拯救 | 第66页 |
| 4.1.6 病毒RNA提取 | 第66页 |
| 4.1.7 反转录多聚酶链反应（RT-PCR） | 第66-67页 |
| 4.1.8 间接免疫荧光 | 第67页 |
| 4.1.9 多步生长曲线的绘制 | 第67页 |
| 4.1.10 空斑形成试验 | 第67页 |
| 4.1.11 小鼠毒力测试 | 第67页 |
| 4.2 结果 | 第67-71页 |
| 4.2.1 JEV HEN0701和HEN-10S3基因组序列差异分析 | 第67-68页 |
| 4.2.2 JEV强、弱毒株结构蛋白编码区相互替换的嵌合病毒的构建及拯救 | 第68-70页 |
| 4.2.3 嵌合病毒的生长特性分析 | 第70页 |
| 4.2.4 病毒结构蛋白编码区序列对病毒神经毒力具有重要影响 | 第70-71页 |
| 4.3 讨论 | 第71-73页 |
| 第五章 JEV E-138突变对病毒神经毒力的影响 | 第73-92页 |
| 5.1 材料与方法 | 第73-80页 |
| 5.1.1 病毒、细胞、质粒 | 第73页 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 | 第73页 |
| 5.1.3 突变PCR | 第73-74页 |
| 5.1.4 E-138突变病毒的构建和拯救 | 第74-75页 |
| 5.1.5 反转录多聚酶链反应（RT-PCR） | 第75-76页 |
| 5.1.6 间接免疫荧光（IFA） | 第76页 |
| 5.1.7 小鼠脑神经细胞制备和原代培养 | 第76页 |
| 5.1.8 生长曲线绘制 | 第76页 |
| 5.1.9 空斑形成试验 | 第76-77页 |
| 5.1.10 脑内神经毒力测试 | 第77页 |
| 5.1.11 组织、细胞总RNA提取 | 第77页 |
| 5.1.12 荧光定量PCR | 第77-79页 |
| 5.1.13 免疫组织化学（IHC） | 第79页 |
| 5.1.14 病毒吸附试验 | 第79页 |
| 5.1.15 HEN0701 E蛋白结构分析 | 第79-80页 |
| 5.2 结果 | 第80-90页 |
| 5.2.1 E-138突变病毒拯救与鉴定 | 第80-81页 |
| 5.2.2 E-138突变病毒体外生长特性分析 | 第81-83页 |
| 5.2.3 E-138位氨基酸酸碱性质影响病毒毒力 | 第83-84页 |
| 5.2.4 E-138R突变病毒体内生长特性分析 | 第84-85页 |
| 5.2.5 E-138R突变病毒在体内引发促炎和抗病毒细胞因子表达能力低 | 第85-86页 |
| 5.2.6 E-138位氨基酸突变影响病毒在细胞表面的吸附能力 | 第86页 |
| 5.2.7 E-138位氨基酸突变改变E蛋白结构 | 第86-90页 |
| 5.3 讨论 | 第90-92页 |
| 第六章 JEV E-47突变导致病毒毒力改变 | 第92-100页 |
| 6.1 材料与方法 | 第92-95页 |
| 6.1.1 病毒、细胞、质粒 | 第92页 |
| 6.1.2 主要试剂和仪器 | 第92页 |
| 6.1.3 E-47突变病毒的构建和拯救 | 第92-94页 |
| 6.1.4 病毒RNA提取 | 第94页 |
| 6.1.5 反转录多聚酶链反应（RT-PCR） | 第94-95页 |
| 6.1.6 间接免疫荧光 | 第95页 |
| 6.1.7 生长曲线绘制 | 第95页 |
| 6.1.8 毒力测试 | 第95页 |
| 6.2 结果 | 第95-98页 |
| 6.2.1 E-47突变病毒的拯救和被拯救病毒的鉴定 | 第95-96页 |
| 6.2.2 被拯救病毒生长曲线的绘制 | 第96-97页 |
| 6.2.3 E-47位氨基酸酸碱性质影响病毒对小鼠的神经毒力 | 第97页 |
| 6.2.4 E-138与E-47位氨基酸的酸碱性质共同决定了病毒对小鼠的神经毒力 | 第97-98页 |
| 6.3 讨论 | 第98-100页 |
| 第七章 全文总结 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 作者简介 | 第111-112页 |
