| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-22页 |
| 1 碱性蛋白酶的研究进展 | 第11-16页 |
| 1.1 碱性蛋白酶的来源 | 第11-12页 |
| 1.2 碱性蛋白酶的分类 | 第12页 |
| 1.3 碱性蛋白酶的性质 | 第12-13页 |
| 1.4 碱性蛋白酶的应用 | 第13-15页 |
| 1.5 高产菌株的选育 | 第15-16页 |
| 1.6 展望 | 第16页 |
| 2 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第16-20页 |
| 2.1 毕赤酵母的表达载体 | 第17页 |
| 2.2 毕赤酵母菌株 | 第17-18页 |
| 2.3 载体的构建、整合和筛选 | 第18页 |
| 2.4 外源蛋白在毕赤酵母中的表达 | 第18-19页 |
| 2.5 毕赤酵母表达系统的前景与展望 | 第19-20页 |
| 3 本研究的前期基础、目的及意义 | 第20-21页 |
| 4 本研究的技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 米曲霉gif-10碱性蛋白酶基因alp1和alp2的克隆和序列分析 | 第22-34页 |
| 1 材料 | 第22-23页 |
| 1.1 菌株及载体 | 第22页 |
| 1.2 生化试剂 | 第22页 |
| 1.3 培养基 | 第22-23页 |
| 1.4 仪器 | 第23页 |
| 2 方法 | 第23-27页 |
| 2.1 米曲霉基因组DNA的提取 | 第23页 |
| 2.2 米曲霉总RNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.3 反转录得到米曲霉cDNA | 第24页 |
| 2.4 PCR扩增得到alp1和alp2基因和CDS序列 | 第24-26页 |
| 2.5 半定量检测alp1和alp2在不同培养基中的表达 | 第26页 |
| 2.6 分析alp1和alp2基因和CDS序列 | 第26-27页 |
| 3 结果 | 第27-33页 |
| 3.1 米曲霉gif-10基因组DNA和总RNA的提取 | 第27-28页 |
| 3.2 PCR扩增得到alp1和alp2基因和CDS序列 | 第28-29页 |
| 3.3 半定量检测alp1和alp2在不同培养基中的表达 | 第29-30页 |
| 3.4 分析alp1和alp2基因和CDS序列 | 第30-33页 |
| 4 讨论 | 第33-34页 |
| 第三章 米曲霉gif-10碱性蛋白酶的毕赤酵母表达 | 第34-43页 |
| 1 材料 | 第34-35页 |
| 1.1 菌株及载体 | 第34页 |
| 1.2 生化试剂 | 第34页 |
| 1.3 培养基 | 第34页 |
| 1.4 仪器 | 第34-35页 |
| 2 方法 | 第35-39页 |
| 2.1 构建毕赤酵母表达载体 | 第35-37页 |
| 2.2 制备毕赤酵母感受态 | 第37页 |
| 2.3 毕赤酵母表达载体的线性化 | 第37页 |
| 2.4 线性化的毕赤酵母表达载体的电击转化和筛选 | 第37-38页 |
| 2.5 诱导重组碱性蛋白酶alp1、alp2和△alp2的表达 | 第38-39页 |
| 3 结果 | 第39-42页 |
| 3.1 构建毕赤酵母表达载体 | 第39页 |
| 3.2 毕赤酵母表达载体的线性化 | 第39-40页 |
| 3.3 毕赤酵母阳性克隆的筛选与鉴定 | 第40-41页 |
| 3.4 诱导重组碱性蛋白酶alp1、alp2和△alp2的表达 | 第41-42页 |
| 4 讨论 | 第42-43页 |
| 第四章 诱导表达重组碱性蛋白酶的纯化和酶学性质分析 | 第43-56页 |
| 1 材料 | 第43-44页 |
| 1.1 菌株及载体 | 第43页 |
| 1.2 生化试剂 | 第43页 |
| 1.3 培养基和溶液 | 第43-44页 |
| 1.4 仪器 | 第44页 |
| 2 方法 | 第44-49页 |
| 2.1 重组碱性蛋白酶的诱导表达和纯化 | 第47-48页 |
| 2.2 最适pH的测定 | 第48页 |
| 2.3 最适温度的测定 | 第48页 |
| 2.4 温度稳定性的测定 | 第48-49页 |
| 2.5 离子和抑制剂对酶活性的影响 | 第49页 |
| 2.6 底物特异性研究 | 第49页 |
| 3 结果 | 第49-54页 |
| 3.1 重组碱性蛋白酶的诱导表达和纯化 | 第49-50页 |
| 3.2 最适pH的测定 | 第50-51页 |
| 3.3 最适温度的测定 | 第51-52页 |
| 3.4 温度稳定性的测定 | 第52页 |
| 3.5 离子和抑制剂对酶活性的影响 | 第52-53页 |
| 3.6 底物特异性研究 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-56页 |
| 结论 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
