| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-30页 |
| 1 问题的由来 | 第15-17页 |
| 2 蛇毒磷脂酶A_2 | 第17页 |
| 3 柿单宁结构 | 第17-18页 |
| 4 多酚与蛋白质相互作用模式 | 第18-25页 |
| 4.1 多酚与蛋白质的非共价相互作用 | 第19-21页 |
| 4.1.1 疏水相互作用力 | 第19-20页 |
| 4.1.2 氢键作用力 | 第20页 |
| 4.1.3 静电相互作用力 | 第20页 |
| 4.1.4 多种所用力共存 | 第20-21页 |
| 4.2 多酚与蛋白质的共价相互作用 | 第21-25页 |
| 4.2.1 O-醌及O-半醌的形成机制 | 第21-22页 |
| 4.2.2 多酚-蛋白质共价键形成机制 | 第22-25页 |
| 4.2.2.1 多酚与巯基共价结合 | 第23-24页 |
| 4.2.2.2 多酚与氨基共价结合 | 第24页 |
| 4.2.2.3 多酚与其他氨基酸共价结合 | 第24页 |
| 4.2.2.4 多酚与蛋白质共价结合 | 第24-25页 |
| 5 多酚蛋白质相互作用对蛋白质性质的影响 | 第25-28页 |
| 5.1 多酚蛋白质相互作用对蛋白质结构的影响 | 第25-26页 |
| 5.2 多酚蛋白质相互作用对蛋白质生物活性的影响 | 第26页 |
| 5.3 多酚蛋白质相互作用对蛋白质其他性质的影响 | 第26-28页 |
| 6 本论文研究的目的意义及主要内容 | 第28-30页 |
| 6.1 本论文研究的目的意义 | 第28页 |
| 6.2 本论文研究的主要内容 | 第28-30页 |
| 第二章 柿单宁特征结构单元对中华眼镜蛇磷脂酶A_2催化活性及毒性的抑制作用 | 第30-52页 |
| 前言 | 第30-32页 |
| 1 材料与方法 | 第32-38页 |
| 1.1 实验材料和仪器设备 | 第32-33页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第32页 |
| 1.1.2 实验动物 | 第32页 |
| 1.1.3 主要试剂 | 第32-33页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第33页 |
| 1.2 实验方法 | 第33-38页 |
| 1.2.1 A型EGCG和ECG二聚体制备 | 第33-34页 |
| 1.2.2 PLA_2赖氨酸、组氨酸、酪氨酸与色氨酸化学修饰 | 第34页 |
| 1.2.3 氨基酸修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2酶活力的影响 | 第34-35页 |
| 1.2.3.1 氨基酸修饰前后PLA_2酶活测定 | 第34-35页 |
| 1.2.3.2 柿单宁特征结构单元单体对PLA_2酶活的抑制作用 | 第35页 |
| 1.2.3.3 柿单宁特征结构单元二聚体对PLA_2酶活抑制作用 | 第35页 |
| 1.2.4 氨基酸修饰与柿单宁特征结构单元对PLA_2致死毒性的影响 | 第35-36页 |
| 1.2.4.1 PLA_2的急性毒性试验 | 第35页 |
| 1.2.4.2 氨基酸化学修饰对PLA_2致死毒性的影响 | 第35页 |
| 1.2.4.3 柿单宁特征结构单元对PLA_2致死毒性的影响 | 第35-36页 |
| 1.2.4.4 小鼠腹腔注射给药的LD_(90)和LD_(50)值测定 | 第36页 |
| 1.2.5 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2神经毒性的影响 | 第36页 |
| 1.2.6 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2肌肉毒性的影响 | 第36-37页 |
| 1.2.7 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2抗凝活性的影响 | 第37页 |
| 1.2.8 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2间接溶血活性的影响 | 第37-38页 |
| 1.2.9 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2致炎活性的影响 | 第38页 |
| 2 结果与分析 | 第38-49页 |
| 2.1 氨基酸修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2酶活的影响 | 第38-40页 |
| 2.2 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2致死毒性的影响 | 第40-42页 |
| 2.2.1 PLA_2的急性毒性试验 | 第40-41页 |
| 2.2.2 氨基酸修饰及与柿单宁特征结构单元反应后PLA_2的致死毒性 | 第41-42页 |
| 2.3 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2神经毒性的影响 | 第42-43页 |
| 2.4 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2肌肉毒性的影响 | 第43-45页 |
| 2.5 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2抗凝活性的影响 | 第45-46页 |
| 2.6 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2溶血活性的影响 | 第46-47页 |
| 2.7 氨基酸化学修饰及柿单宁特征结构单元对PLA_2致炎活性的影响 | 第47-49页 |
| 3 讨论 | 第49-51页 |
| 3.1 中华眼镜蛇PLA_2的部分毒性存在独立的活性位点 | 第49页 |
| 3.2 EGCG二聚体和ECG二聚体是柿单宁解蛇毒的结构基础 | 第49-51页 |
| 4 小结 | 第51-52页 |
| 第三章 柿单宁特征结构单元对中华眼镜蛇磷脂酶A_2结构的影响 | 第52-69页 |
| 前言 | 第52-53页 |
| 1 材料与方法 | 第53-56页 |
| 1.1 实验材料和仪器设备 | 第53-54页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第53页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第53页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第53-54页 |
| 1.2 实验方法 | 第54-56页 |
| 1.2.1 与柿单宁特征结构单元反应前后PLA_2粒径测定 | 第54页 |
| 1.2.2 与柿单宁特征结构单元反应前后PLA_2 zeta-电位测定 | 第54页 |
| 1.2.3 与柿单宁特征结构单元反应前后PLA_2二级结构测定 | 第54-55页 |
| 1.2.4 与柿单宁特征结构单元反应前后PLA_2热稳定性测定 | 第55页 |
| 1.2.5 与柿单宁特征结构单元反应前后PLA_2表面疏水性测定 | 第55-56页 |
| 1.2.6 与柿单宁特征结构单元反应前后PLA_2亲/疏水性测定 | 第56页 |
| 1.2.7 统计分析 | 第56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-66页 |
| 2.1 柿单宁特征结构单元对PLA_2 zeta-电位及分子大小的影响 | 第56-58页 |
| 2.2 柿单宁特征结构单元对PLA_2二级结构的影响 | 第58-61页 |
| 2.3 柿单宁特征结构单元对PLA_2热稳定性的影响 | 第61-63页 |
| 2.4 柿单宁特征结构单元对PLA_2表面疏水性的影响 | 第63-64页 |
| 2.5 柿单宁特征结构单元对PLA_2亲/疏水性的影响 | 第64-66页 |
| 3 讨论 | 第66-68页 |
| 3.1 柿单宁对PLA_2构象的干扰是其解蛇毒的机制之一 | 第66-67页 |
| 3.2 His、Lys、Trp、Tyr可能参与了柿单宁与PLA_2的相互作用 | 第67-68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 柿单宁特征结构单元与中华眼镜蛇磷脂酶A_2相互作用模式探索 | 第69-91页 |
| 前言 | 第69-70页 |
| 1 材料与方法 | 第70-76页 |
| 1.1 实验材料和仪器设备 | 第70-71页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第70页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第70-71页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第71页 |
| 1.2 实验方法 | 第71-76页 |
| 1.2.1 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用动力学分析(SPR) | 第71-73页 |
| 1.2.1.1 芯片制备 | 第71-73页 |
| 1.2.1.2 PLA_2样品处理 | 第73页 |
| 1.2.1.3 柿单宁特征结构单元与PLA_2结合的实时监测 | 第73页 |
| 1.2.2 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用热力学分析 (ITC) | 第73-74页 |
| 1.2.3 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用SDS-PAGE/NBT分析 | 第74-75页 |
| 1.2.3.1 样品制备 | 第74页 |
| 1.2.3.2 SDS-PAGE | 第74页 |
| 1.2.3.3 半干分子印迹法 | 第74-75页 |
| 1.2.4 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用MALDI-TOF/MS分析 | 第75页 |
| 1.2.5 未氧化柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用SDS-PAGE/NBT分析 | 第75页 |
| 1.2.6 柿单宁特征结构单元与变性PLA_2相互作用SDS-PAGE/NBT分析 | 第75-76页 |
| 1.2.6.1 变性PLA_2的制备 | 第75页 |
| 1.2.6.2 变性PLA_2的ANS测定 | 第75页 |
| 1.2.6.3 SDS-PAGE/NBT | 第75-76页 |
| 2 结果与分析 | 第76-88页 |
| 2.1 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用动力学分析 | 第76-79页 |
| 2.1.1 柿单宁特征结构单元与PLA_2结合的动力学曲线 | 第76-77页 |
| 2.1.2 柿单宁特征结构单元与PLA_2结合的动力学参数 | 第77-78页 |
| 2.1.3 柿单宁特征结构单元与PLA_2结合的动力学分布图 | 第78-79页 |
| 2.2 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用热力学分析 | 第79-82页 |
| 2.3 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用SDS-PAGE/NBT分析 | 第82-83页 |
| 2.4 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用MALDI-TOF/MS分析 | 第83-85页 |
| 2.5 柿单宁特征结构单元与PLA_2共价结合机制探索 | 第85-88页 |
| 2.5.1 柿单宁特征结构单元自氧化对两者共价结合的影响 | 第85-86页 |
| 2.5.2 PLA_2的构象对两者共价结合的影响 | 第86-88页 |
| 3 讨论 | 第88-90页 |
| 3.1 柿单宁特征结构单元对PLA_2表现出很高的结合亲和力 | 第88页 |
| 3.2 柿单宁特征结构单元的B环与PLA_2发生共价交联 | 第88-89页 |
| 3.3 柿单宁特征结构单元与PLA_2共价交联分为两个步骤 | 第89-90页 |
| 4 小结 | 第90-91页 |
| 第五章 柿单宁特征结构单元与中华眼镜蛇磷脂酶A_2相互作用位点分析 | 第91-128页 |
| 前言 | 第91-92页 |
| 1 材料与方法 | 第92-98页 |
| 1.1 实验材料和仪器设备 | 第92-94页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第92页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第92-93页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第93-94页 |
| 1.2 实验方法 | 第94-98页 |
| 1.2.1 计算机模拟柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用 | 第94页 |
| 1.2.1 PLA_2氨基酸修饰 | 第94页 |
| 1.2.3 柿单宁特征结构单元与氨基酸修饰后PLA_2热力学相互作用测定 | 第94页 |
| 1.2.4 柿单宁特征结构单元与氨基酸修饰后PLA_2热稳定性测定 | 第94页 |
| 1.2.5 柿单宁特征结构单元与氨基酸修饰后PLA_2表面疏水性测定 | 第94页 |
| 1.2.6 柿单宁特征级分PT40与氨基酸修饰后PLA_2沉淀率测定 | 第94-95页 |
| 1.2.7 柿单宁特征结构单元与氨基酸修饰后PLA_2的SDS-PAGE/NBT分析 | 第95页 |
| 1.2.8 柿单宁特征结构单元与PLA_2结合前后自由氨基、色氨酸和酪氨酸含量测定 | 第95-97页 |
| 1.2.8.1 自由氨基测定 | 第95-96页 |
| 1.2.8.2 色氨酸残基含量测定 | 第96页 |
| 1.2.8.3 酪氨酸残基含量测定 | 第96-97页 |
| 1.2.9 柿单宁特征结构单元与PLA_2相互作用后LC-MS/MS分析 | 第97-98页 |
| 1.2.9.1 柿单宁特征结构单元-PLA_2SDS-PAGE处理 | 第97页 |
| 1.2.9.2 柿单宁特征结构单元-PLA_2胶内酶解 | 第97-98页 |
| 1.2.9.3 HPLC-MS/MS条件设置 | 第98页 |
| 1.2.9.4 数据分析 | 第98页 |
| 2 结果与分析 | 第98-125页 |
| 2.1 计算机模拟柿单宁特征结构单元与PLA_2的相互作用位点 | 第98-102页 |
| 2.2 氨基酸修饰对柿单宁结构单元与PLA_2热力学相互作用的影响 | 第102-108页 |
| 2.3 氨基酸修饰对柿单宁特征结构单元-PLA_2热稳定性的影响 | 第108-110页 |
| 2.4 氨基酸修饰对柿单宁特征结构单元-PLA_2表面疏水性的影响 | 第110-113页 |
| 2.5 氨基酸修饰对PLA_2与柿单宁沉淀形成的影响 | 第113-114页 |
| 2.6 柿单宁特征结构单元与氨基酸修饰后PLA_2相互作用SDS-PAGE/NBT分析 | 第114-116页 |
| 2.7 PLA_2与柿单宁特征结构单元反应前后自由氨基、色氨酸和酪氨酸残基含量测定 | 第116-117页 |
| 2.8 柿单宁特征结构单元与PLA_2结合后LC-MS/MS分析 | 第117-125页 |
| 2.8.1 PLA_2-EGCG共价位点分析 | 第118-119页 |
| 2.8.2 PLA_2-ECG共价位点分析 | 第119-121页 |
| 2.8.3 PLA_2-EGCG二聚体共价位点分析 | 第121-125页 |
| 3 讨论 | 第125-127页 |
| 3.1 联合多种方法对柿单宁结构单元与PLA_2的共价位点进行研究具有可靠性 | 第125-126页 |
| 3.2 柿单宁结构单元与PLA_2关键活性氨基酸发生相互作用是其解蛇毒机制之一 | 第126-127页 |
| 4 小结 | 第127-128页 |
| 第六章 结论与展望 | 第128-130页 |
| 1 结论 | 第128-129页 |
| 2 展望 | 第129-130页 |
| 参考文献 | 第130-148页 |
| 在读期间发表的论文 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
