| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 序言 | 第13-20页 |
| 1.1 血吸虫及血吸虫病概况 | 第13-15页 |
| 1.1.1 血吸虫的分类 | 第13页 |
| 1.1.2 血吸虫病的流行情况 | 第13-14页 |
| 1.1.3 血吸虫的形态及生活史 | 第14-15页 |
| 1.1.4 血吸虫病的危害及症状 | 第15页 |
| 1.2 血吸虫侵染过程中的关键尾蚴蛋白酶研究进展 | 第15-19页 |
| 1.2.1 半胱氨酸蛋白酶的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.1.1 曼氏血吸虫中半胱氨酸蛋白酶的研究 | 第16页 |
| 1.2.1.2 日本血吸虫中半胱氨酸蛋白酶的研究 | 第16-17页 |
| 1.2.1.3 其他血吸虫中半胱氨酸蛋白酶的研究 | 第17页 |
| 1.2.2 丝氨酸蛋白酶的相关研究 | 第17-19页 |
| 1.2.2.1 曼氏血吸虫丝氨酸蛋白酶的研究 | 第17-18页 |
| 1.2.2.2 日本血吸虫丝氨酸蛋白酶的研究 | 第18-19页 |
| 1.2.3 钙蛋白酶的相关研究 | 第19页 |
| 1.3 小结 | 第19页 |
| 1.4 研究意义 | 第19-20页 |
| 第2章 实验材料与仪器设备 | 第20-23页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 日本血吸虫尾蚴 | 第20页 |
| 2.1.2 动物 | 第20页 |
| 2.1.3 载体和菌株 | 第20页 |
| 2.1.4 酶和Marker | 第20页 |
| 2.1.5 试剂盒 | 第20页 |
| 2.1.6 抗生素 | 第20页 |
| 2.1.7 抗体 | 第20页 |
| 2.1.8 纯化介质和预装柱 | 第20页 |
| 2.1.9 酶活测定底物 | 第20页 |
| 2.1.10 抑制剂 | 第20-21页 |
| 2.1.11 常用溶液及培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.12 其它 | 第22页 |
| 2.2 主要仪器设备 | 第22-23页 |
| 第3章 尾蚴可溶性抽提总蛋白和分泌蛋白的蛋白质组分析 | 第23-28页 |
| 3.1 实验方法 | 第23-24页 |
| 3.1.1 尾蚴分泌蛋白的收集 | 第23页 |
| 3.1.2 尾蚴总蛋白的收集 | 第23页 |
| 3.1.3 质谱分析 | 第23-24页 |
| 3.2 实验结果 | 第24-27页 |
| 3.2.1 尾蚴可溶性抽提总蛋白质谱鉴定结果 | 第24页 |
| 3.2.2 尾蚴分泌蛋白质谱鉴定结果 | 第24-27页 |
| 3.3 总结与讨论 | 第27-28页 |
| 第4章 日本血吸虫组织蛋白酶B2(SJCB2)的表达及功能分析 | 第28-54页 |
| 4.1 实验方法 | 第28-40页 |
| 4.1.1 SjCB2的生物信息学分析 | 第28页 |
| 4.1.1.1 基因序列及开放阅读框 | 第28页 |
| 4.1.1.2 同源序列搜索 | 第28页 |
| 4.1.1.3 同源序列比对 | 第28页 |
| 4.1.1.4 构建进化树 | 第28页 |
| 4.1.1.5 分子量及等电点预测 | 第28页 |
| 4.1.1.6 蛋白信号肽预测 | 第28页 |
| 4.1.1.7 蛋白功能位点及结构域分析 | 第28页 |
| 4.1.2 SjCB2的原核表达及纯化 | 第28-33页 |
| 4.1.2.1 SjCB2基因的扩增及双酶切 | 第28-30页 |
| 4.1.2.2 pGEX-h-6t-1载体片段的制备 | 第30-31页 |
| 4.1.2.3 重组质粒的构建 | 第31页 |
| 4.1.2.4 重组蛋白的诱导和表达 | 第31-32页 |
| 4.1.2.5 重组蛋白的纯化 | 第32-33页 |
| 4.1.3 兔多克隆抗血清的制备 | 第33-34页 |
| 4.1.3.1 蛋白样品的处理 | 第33页 |
| 4.1.3.2 多克隆抗血清的制备 | 第33页 |
| 4.1.3.3 ELISA检测兔多抗滴度 | 第33-34页 |
| 4.1.3.4 吸附GST抗体 | 第34页 |
| 4.1.3.4.1 原核表达GST蛋白 | 第34页 |
| 4.1.3.4.2 GST蛋白的纯化 | 第34页 |
| 4.1.3.4.3 SjCB2兔多抗中GST抗体的吸附 | 第34页 |
| 4.1.4 Western blot分析SjCB2兔多克隆抗体免疫原性 | 第34-35页 |
| 4.1.5 SjCB2在尾蚴组织中的免疫荧光定位 | 第35-36页 |
| 4.1.5.1 制片 | 第35页 |
| 4.1.5.2 免疫荧光定位 | 第35-36页 |
| 4.1.6 麦胚无细胞(Wheat germ cell-free,WGCF)蛋白表达体系表达SjCB2蛋白 | 第36-39页 |
| 4.1.6.1 无细胞表达引物设计 | 第36页 |
| 4.1.6.2 SjCB2基因的扩增 | 第36-37页 |
| 4.1.6.3 载体线性化 | 第37页 |
| 4.1.6.4 无缝克隆 | 第37页 |
| 4.1.6.5 转化 | 第37-38页 |
| 4.1.6.6 重组质粒的鉴定 | 第38页 |
| 4.1.6.7 重组质粒体外转录 | 第38-39页 |
| 4.1.6.8 体外翻译 | 第39页 |
| 4.1.6.9 Western blot检测蛋白表达 | 第39页 |
| 4.1.7 SjCB2酶活测定 | 第39-40页 |
| 4.1.7.1 尾蚴总蛋白的抽提 | 第39页 |
| 4.1.7.2 尾蚴分泌蛋白的收集 | 第39页 |
| 4.1.7.3 SjCB2酶活测定 | 第39-40页 |
| 4.1.7.3.1 反应底物与测定方法 | 第39-40页 |
| 4.1.7.3.2 酶活测定 | 第40页 |
| 4.1.8 尾蚴侵染抑制实验 | 第40页 |
| 4.2 实验结果 | 第40-52页 |
| 4.2.1 生物信息学分析 | 第40-42页 |
| 4.2.1.1 基因序列及开放阅读框架 | 第40-41页 |
| 4.2.1.2 二级结构的预测 | 第41页 |
| 4.2.1.3 多重序列联配分析 | 第41页 |
| 4.2.1.4 构建分子进化树 | 第41-42页 |
| 4.2.2 SJCB2的克隆、表达及纯化 | 第42-43页 |
| 4.2.2.1 SjCB2基因的扩增 | 第42页 |
| 4.2.2.2 重组质粒的构建 | 第42-43页 |
| 4.2.3 重组SjCB2蛋白在大肠杆菌中诱导表达 | 第43-44页 |
| 4.2.4 SjCB2重组蛋白的纯化 | 第44页 |
| 4.2.5 SjCB2兔多克隆抗体滴度 | 第44-47页 |
| 4.2.5.1 GST蛋白的诱导表达 | 第44-45页 |
| 4.2.5.2 GST蛋白的纯化 | 第45页 |
| 4.2.5.3 GST蛋白的浓度测定 | 第45-46页 |
| 4.2.5.4 SjCB2兔多克隆抗体滴度 | 第46-47页 |
| 4.2.6 SjCB2蛋白免疫原性分析 | 第47页 |
| 4.2.7 SjCB2在尾蚴组织中的免疫荧光定位 | 第47-48页 |
| 4.2.8 SjCB2的无细胞表达 | 第48-50页 |
| 4.2.8.1 SjCB2基因的扩增 | 第48-49页 |
| 4.2.8.2 SjB2基因In-fusion克隆重组子鉴定 | 第49页 |
| 4.2.8.3 Western blot验证SjCB2蛋白的无细胞表达 | 第49-50页 |
| 4.2.9 酶活测定 | 第50-51页 |
| 4.2.9.1 尾蚴总蛋白浓度测定 | 第50页 |
| 4.2.9.2 尾蚴分泌蛋白浓度测定 | 第50-51页 |
| 4.2.9.3 SjCB2无细胞表达产物浓度测定 | 第51页 |
| 4.2.9.4 酶活测定 | 第51页 |
| 4.2.10 尾蚴侵染抑制实验 | 第51-52页 |
| 4.3 总结与讨论 | 第52-54页 |
| 第5章 日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶(SJCE2b)的表达及功能分析 | 第54-63页 |
| 5.1 实验方法 | 第54-55页 |
| 5.1.1 SjCE2b蛋白的原核表达 | 第54页 |
| 5.1.2 SjCE2b重组蛋白的纯化 | 第54页 |
| 5.1.3 ELISA检测SjCE2b兔多抗滴度 | 第54页 |
| 5.1.4 SjCE2b兔多抗的纯化 | 第54页 |
| 5.1.5 SjCE2b蛋白的免疫荧光定位 | 第54页 |
| 5.1.6 SjCE2b兔多抗抑制尾蚴侵染实验 | 第54-55页 |
| 5.1.7 WGCF体系表达重组SjCE2b蛋白 | 第55页 |
| 5.1.8 SjCE2b蛋白酶活测定 | 第55页 |
| 5.1.9 SjCE2b抑制剂抑制尾蚴侵染实验 | 第55页 |
| 5.2 实验结果 | 第55-61页 |
| 5.2.1 重组SjCE2b蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第55-56页 |
| 5.2.2 SjCE2b重组蛋白的纯化 | 第56页 |
| 5.2.3 SjCE2b兔多克隆抗体滴度 | 第56页 |
| 5.2.4 SjCE2b在尾蚴组织中的免疫荧光定位 | 第56-57页 |
| 5.2.5 SjCE2b兔多抗抑制尾蚴侵染实验 | 第57-58页 |
| 5.2.6 WGCF体系表达重组SjCE2b蛋白 | 第58-60页 |
| 5.2.6.1 SjCE2b基因的扩增 | 第58页 |
| 5.2.6.2 SjCE2b基因In-fusion克隆重组子鉴定 | 第58-59页 |
| 5.2.6.3 Western blot验证SjCE2b蛋白的无细胞表达 | 第59-60页 |
| 5.2.7 SjCE2b蛋白酶活测定 | 第60-61页 |
| 5.2.7.1 SjCE2b无细胞表达产物浓度测定 | 第60页 |
| 5.2.7.2 SjCE2b酶活测定 | 第60-61页 |
| 5.2.8 SjCE2b抑制剂抑制尾蚴侵染实验 | 第61页 |
| 5.3 总结与讨论 | 第61-63页 |
| 第6章 日本血吸虫钙蛋白基因(SJCALPAIN)的原核表达及功能分析 | 第63-71页 |
| 6.1 实验方法 | 第63-65页 |
| 6.1.1 Sjcalpain的生物信息学分析 | 第63页 |
| 6.1.2 Sjcalpain催化位点区域和Ca~(2+)结合位点区域编码基因的扩增 | 第63-64页 |
| 6.1.2.1 引物设计 | 第63页 |
| 6.1.2.2 PCR扩增 | 第63-64页 |
| 6.1.3 PCR产物双酶切及回收 | 第64页 |
| 6.1.4 pET-28a载体片段的制备 | 第64页 |
| 6.1.5 重组质粒的构建 | 第64页 |
| 6.1.6 重组蛋白的诱导和表达 | 第64页 |
| 6.1.7 重组蛋白的纯化 | 第64页 |
| 6.1.8 Sjcalpain催化位点和Ca~(2+)结合位点蛋白兔多克隆抗血清的制备 | 第64-65页 |
| 6.1.9 Western blot分析Sjcalpain催化位点和Ca~(2+)结合位点蛋白兔多克隆抗体免疫原性 | 第65页 |
| 6.1.10 Sjcalpain在尾蚴组织中的免疫荧光定位 | 第65页 |
| 6.2 实验结果 | 第65-69页 |
| 6.2.1 生物信息学分析 | 第65-66页 |
| 6.2.2 Sjcalpain催化位点蛋白和Ca~(2+)结合位点蛋白编码基因的扩增与重组质粒的鉴定 | 第66页 |
| 6.2.3 重组蛋白的原核表达及纯化 | 第66-67页 |
| 6.2.4 Sjcalpain催化位点和Ca~(2+)结合位点兔多克隆抗血清的制备及滴度测定 | 第67-68页 |
| 6.2.5 Sjcalpain在尾蚴中的组织定位 | 第68-69页 |
| 6.2.6 尾蚴侵染抑制实验 | 第69页 |
| 6.3 总结与讨论 | 第69-71页 |
| 第7章 日本血吸虫尾蚴分泌物中其它蛋白酶的原核表达 | 第71-92页 |
| 7.1 金属内切肽酶(SJME)的原核表达及多抗制备 | 第71-76页 |
| 7.1.1 实验方法 | 第71-72页 |
| 7.1.1.1 SjME的生物信息学分析 | 第71页 |
| 7.1.1.2 SjME的基因扩增 | 第71页 |
| 7.1.1.2.1 引物设计 | 第71页 |
| 7.1.1.2.2 PCR扩增 | 第71页 |
| 7.1.1.3 PCR产物双酶切及回收 | 第71-72页 |
| 7.1.1.4 pET-28a载体片段的制备 | 第72页 |
| 7.1.1.5 重组质粒的构建 | 第72页 |
| 7.1.1.6 重组蛋白的诱导和表达 | 第72页 |
| 7.1.1.7 SjME重组蛋白的纯化 | 第72页 |
| 7.1.1.8 SjME蛋白兔多克隆抗血清的制备 | 第72页 |
| 7.1.2 实验结果 | 第72-76页 |
| 7.1.2.1 SjME生物信息学分析 | 第72页 |
| 7.1.2.2 SjME蛋白编码基因的扩增与重组质粒的鉴定 | 第72-73页 |
| 7.1.2.3 重组SjME蛋白的诱导表达 | 第73页 |
| 7.1.2.4 重组SjME蛋白表达形式 | 第73-74页 |
| 7.1.2.5 重组SjME蛋白的纯化 | 第74页 |
| 7.1.2.6 SjME兔多抗制备 | 第74-76页 |
| 7.1.2.6.1 SjME蛋白样品准备 | 第74-75页 |
| 7.1.2.6.2 SjME兔多克隆抗血清滴度测定 | 第75-76页 |
| 7.2 M17氨基肽酶(SJM17)的原核表达及多抗制备 | 第76-80页 |
| 7.2.1 实验方法 | 第76页 |
| 7.2.1.1 SjM17的生物信息学分析 | 第76页 |
| 7.2.1.2 SjM17的克隆、原核表达和纯化 | 第76页 |
| 7.2.1.3 SjM17蛋白兔多克隆抗血清的制备 | 第76页 |
| 7.2.2 实验结果 | 第76-80页 |
| 7.2.2.1 生物信息学分析 | 第76-77页 |
| 7.2.2.2 SjM17蛋白编码基因的扩增 | 第77页 |
| 7.2.2.3 SjM17/pET-28a重组质粒的鉴定 | 第77-78页 |
| 7.2.2.4 重组SJM17蛋白的诱导表达 | 第78页 |
| 7.2.2.5 重组SjM17蛋白表达形式检测 | 第78-79页 |
| 7.2.2.6 重组SjM17蛋白的纯化 | 第79页 |
| 7.2.2.7 SjM17兔多抗制备 | 第79-80页 |
| 7.2.2.7.1 SjM17蛋白样品准备 | 第79页 |
| 7.2.2.7.2 SjM17兔多克隆抗血清滴度测定 | 第79-80页 |
| 7.3 线粒体金属肽酶M16(SJM16)的克隆表达及多克隆抗体制备 | 第80-84页 |
| 7.3.1 实验方法 | 第80-81页 |
| 7.3.1.1 SjM16的生物信息学分析 | 第80页 |
| 7.3.1.2 SjM16的克隆、原核表达和纯化 | 第80-81页 |
| 7.3.1.3 SjM16蛋白兔多克隆抗血清的制备 | 第81页 |
| 7.3.2 实验结果 | 第81-84页 |
| 7.3.2.1 生物信息学分析 | 第81页 |
| 7.3.2.2 SjM16 PCR扩增产物鉴定 | 第81页 |
| 7.3.2.3 SjM16/pET-28a重组表达质粒的鉴定 | 第81-82页 |
| 7.3.2.4 重组SjM16蛋白的诱导表达 | 第82页 |
| 7.3.2.5 重组SjM16蛋白表达形式检测 | 第82-83页 |
| 7.3.2.6 重组SjM16蛋白的纯化 | 第83页 |
| 7.3.2.7 SjM16兔多抗制备 | 第83-84页 |
| 7.3.2.7.1 SjM16蛋白样品准备 | 第83-84页 |
| 7.3.2.7.2 SjM16兔多克隆抗血清滴度测定 | 第84页 |
| 7.4 蛋白酶体B型7亚单位(SJP7)的克隆表达及复性 | 第84-90页 |
| 7.4.1 实验方法 | 第84-87页 |
| 7.4.1.1 SjP7的生物信息学分析 | 第84页 |
| 7.4.1.2 SjP7的克隆和原核表达 | 第84-85页 |
| 7.4.1.3. SjP7包涵体蛋白的处理 | 第85页 |
| 7.4.1.4 SjP7变性蛋白复性条件筛选 | 第85-87页 |
| 7.4.1.4.1 Bradford法测定纯化后SjP7变性蛋白浓度 | 第85页 |
| 7.4.1.4.2 复性条件筛选 | 第85-86页 |
| 7.4.1.4.3 复性放大及纯化 | 第86页 |
| 7.4.1.4.4 复性蛋白纯化 | 第86-87页 |
| 7.4.2 实验结果 | 第87-90页 |
| 7.4.2.1 生物信息学分析 | 第87页 |
| 7.4.2.2 SjP7 PCR扩增产物鉴定 | 第87页 |
| 7.4.2.3 酶切产物切胶回收 | 第87页 |
| 7.4.2.4 SjP7/pET-28a重组表达质粒的鉴定 | 第87-88页 |
| 7.4.2.5 重组SjP7蛋白的诱导表达 | 第88页 |
| 7.4.2.6 重组SjP7蛋白表达形式检测 | 第88-89页 |
| 7.4.2.7 SjP7变性蛋白浓度测定 | 第89页 |
| 7.4.2.8 复性条件筛选 | 第89-90页 |
| 7.4.2.9 复性条件放大和纯化 | 第90页 |
| 7.5 总结与讨论 | 第90-92页 |
| 第8章 总结与展望 | 第92-95页 |
| 8.1 总结 | 第92-93页 |
| 8.2 创新点 | 第93页 |
| 8.3 展望 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-98页 |
| 附录 | 第98-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 硕士期间论文发表情况 | 第112-113页 |
