| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-22页 |
| 0 前言 | 第22-47页 |
| 1 水产养殖业及细菌性病害 | 第22-25页 |
| 2 主要致病性弧菌的研究进展 | 第25-34页 |
| ·副溶血弧菌 | 第25-29页 |
| ·副溶血弧菌的致病性 | 第25页 |
| ·副溶血弧菌致病机制及主要毒力因子 | 第25-29页 |
| ·副溶血弧菌对宿主的粘附作用(Adhesion) | 第26页 |
| ·溶血素(Haemolysin) | 第26-27页 |
| ·胞外蛋白酶 | 第27-29页 |
| ·脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS) | 第29页 |
| ·鳗弧菌 | 第29-32页 |
| ·鳗弧菌的致病性 | 第29-30页 |
| ·鳗弧菌的致病机制及主要毒力因子 | 第30-32页 |
| ·鳗弧菌对宿主的粘附作用 | 第30页 |
| ·毒力质粒(Virulence plasmid)和摄铁系统(Iron-sequencing system) | 第30-31页 |
| ·溶血素 | 第31-32页 |
| ·脂多糖 | 第32页 |
| ·鳗弧菌的胞外金属蛋白酶(Metalloprotease) | 第32页 |
| ·外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP) | 第32页 |
| ·哈维氏弧菌 | 第32-34页 |
| ·哈维氏弧菌的致病性 | 第33-34页 |
| ·哈维氏弧菌的致病机制 | 第34页 |
| 3. DNA 疫苗在水产养殖中的应用 | 第34-46页 |
| ·DNA 疫苗的优点 | 第35-36页 |
| ·鱼类疫苗的需求 | 第35页 |
| ·DNA 疫苗的优点 | 第35-36页 |
| ·DNA 疫苗的构建 | 第36-37页 |
| ·控制元件 | 第36页 |
| ·抗原表达基因 | 第36-37页 |
| ·DNA 作为免疫激活分子 | 第37页 |
| ·实施方案 | 第37-40页 |
| ·注射免疫 | 第37-39页 |
| ·注射位点 | 第37-38页 |
| ·注射剂量 | 第38页 |
| ·外源基因在鱼体内的表达部位 | 第38-39页 |
| ·DNA 疫苗的持续性和对组织的免疫效果 | 第39页 |
| ·针头注射的替代方式 | 第39页 |
| ·口服与浸泡免疫 | 第39-40页 |
| ·DNA 疫苗引起的免疫反应 | 第40-43页 |
| ·抗体反应 | 第41-42页 |
| ·细胞免疫反应 | 第42-43页 |
| ·对病原感染的保护 | 第43页 |
| ·DNA 疫苗对鱼类的安全性 | 第43-45页 |
| ·DNA 疫苗在鱼体内的命运 | 第44页 |
| ·口服DNA 疫苗免疫后的安全性 | 第44页 |
| ·DNA 疫苗对其他鱼类和环境的影响 | 第44-45页 |
| ·DNA 疫苗在水产养殖业的发展前景 | 第45-46页 |
| 4 本论文的研究目的和意义 | 第46-47页 |
| 第一章 副溶血弧菌假定丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化、定点突变及其 DNA 疫苗的研制 | 第47-86页 |
| 1 材料与方法 | 第47-71页 |
| ·菌株和质粒 | 第47-49页 |
| ·实验动物 | 第49页 |
| ·细胞系 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49-51页 |
| ·试剂及仪器 | 第51-52页 |
| ·试剂 | 第51-52页 |
| ·仪器 | 第52页 |
| ·副溶血弧菌假定丝氨酸蛋白酶基因vps 的原核表达 | 第52-58页 |
| ·原核表达质粒的构建及鉴定 | 第52-57页 |
| ·引物设计及合成 | 第52-53页 |
| ·副溶血弧菌FYZ8621.4vps 基因的PCR 扩增及pMD19-T Simple/vps 克隆质粒的构建 | 第53-54页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第54页 |
| ·表达质粒的转化 | 第54-55页 |
| ·质粒DNA 提取及鉴定 | 第55-57页 |
| ·原核表达质粒的构建 | 第57页 |
| ·原核表达质粒的转化及鉴定 | 第57页 |
| ·假定丝氨酸蛋白酶基因vps 在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化 | 第57-58页 |
| ·原核表达质粒pET-28a(+)/vps 在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达 | 第57-58页 |
| ·假定丝氨酸蛋白酶基因vps 表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测 | 第58页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶的纯化 | 第58-60页 |
| ·重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)/vps 的诱导及培养 | 第58页 |
| ·从菌体中纯化假定丝氨酸蛋白酶 | 第58页 |
| ·从培养上清液中纯化假定丝氨酸蛋白酶 | 第58页 |
| ·Ni 琼脂糖亲和柱亲和层析 | 第58-59页 |
| ·Ni 琼脂糖亲和柱的处理与再生 | 第59-60页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶的性质研究 | 第60-61页 |
| ·利用生物信息学分析重组假定丝氨酸蛋白酶的理化性质以及预测信号肽 | 第60页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶蛋白水解活力的测定 | 第60页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶底物特异性分析 | 第60页 |
| ·化学试剂对纯化的假定丝氨酸蛋白酶的水解活性的影响 | 第60-61页 |
| ·温度及pH 对重组假定丝氨酸蛋白酶水解活力的影响 | 第61页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶的致病性研究 | 第61页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶溶血活性及水解卵磷脂的实验 | 第61页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶对斑马鱼的致病性 | 第61页 |
| ·PCR 定点突变研究假定丝氨酸蛋白酶的活性位点 | 第61-65页 |
| ·以pMD19-T Simple/vps 质粒为模板的定点突变 | 第61-63页 |
| ·突变位点的选取 | 第61-62页 |
| ·突变引物的设计和合成 | 第62页 |
| ·利用PCR 以pMD19-T Simple/vps 为模板对 vps 基因进行定点突变 | 第62-63页 |
| ·突变质粒的转化 | 第63页 |
| ·突变质粒的鉴定 | 第63页 |
| ·突变表达质粒的构建 | 第63页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第63-64页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶基因m-vps 在大肠杆菌中的表达 | 第63页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶的SDS-PAGE 电泳检测 | 第63-64页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶的纯化 | 第64-65页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶的纯化 | 第64页 |
| ·纯化的突变假定丝氨酸蛋白酶的SDS-PAGE 电泳检测 | 第64页 |
| ·纯化的突变假定丝氨酸蛋白酶的Western-blot 检测 | 第64-65页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶活性的测定 | 第65页 |
| ·突变假定丝氨酸蛋白酶基因m-vps 的真核表达 | 第65-68页 |
| ·突变假定丝氨酸蛋白酶基因m-vps 真核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第65-66页 |
| ·引物设计及合成 | 第65-66页 |
| ·真核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第66页 |
| ·真核细胞转染及表达产物的检测 | 第66-68页 |
| ·真核重组表达质粒pEGFP-N1/m-vps 转染HeLa 细胞 | 第66-67页 |
| ·转染细胞的荧光观察 | 第67-68页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-vps 对大菱鲆免疫效果的研究 | 第68-71页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-vps 的大量提取 | 第68页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第68页 |
| ·实验动物处理及免疫 | 第68页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-vps 在大菱鲆体内表达产物的检测 | 第68-70页 |
| ·反转录PCR(RT-PCR)检测突变的假定丝氨酸蛋白酶基因m-vps在大菱鲆体内的表达 | 第68-70页 |
| ·Western-blot 检测突变的假定丝氨酸蛋白酶基因m-vps 在大菱鲆体内的表达 | 第70页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-vps 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第70页 |
| ·免疫大菱鲆血清中抗体水平测定 | 第70-71页 |
| 2 结果与分析 | 第71-84页 |
| ·副溶血弧菌FYZ8621.4 假定丝氨酸蛋白酶基因vps 在大肠杆菌中表达 | 第71-73页 |
| ·假定丝氨酸蛋白酶基因vps 克隆及序列分析 | 第71-73页 |
| ·pET-28a(+)/vps 表达质粒的构建、鉴定以及表达条件的优化 | 第73页 |
| ·从菌体中纯化重组假定丝氨酸蛋白酶 | 第73-74页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶的性质研究 | 第74-77页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶水解蛋白的活力及水解底物的特异性 | 第74页 |
| ·化学试剂对重组假定丝氨酸蛋白酶水解活性的影响 | 第74-75页 |
| ·温度及pH 对重组假定丝氨酸蛋白酶水解活力的影响 | 第75-76页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶溶血活性及水解卵磷脂活性 | 第76页 |
| ·重组假定丝氨酸蛋白酶对斑马鱼的毒性 | 第76-77页 |
| ·PCR 定点突变研究假定丝氨酸蛋白酶活性位点 | 第77-79页 |
| ·以pMD19-T Simple/vps 质粒为模板的定点突变 | 第77页 |
| ·突变位点的选取 | 第77页 |
| ·利用PCR 以pMD19-T Simple/vps 为模板对 vps 基因进行定点突变 | 第77页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶基因m-vps 在大肠杆菌中的表达 | 第77-78页 |
| ·突变的假定丝氨酸蛋白酶的纯化 | 第78页 |
| ·突变对假定丝氨酸蛋白酶活性的影响 | 第78-79页 |
| ·副溶血弧菌FYZ8621.4 重组假定丝氨酸蛋白酶的突变基因m-vps 在真核细胞中的表达 | 第79-81页 |
| ·pEGFP-N1/m-vps 真核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第79-80页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第80页 |
| ·荧光观察检测pEGFP-N1 | 第80-81页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-vps 对大菱鲆的免疫效果研究 | 第81-84页 |
| ·提取的重组质粒的纯度检测 | 第81页 |
| ·pEGFP-N1/m-vps 真核表达质粒在大菱鲆体内的表达 | 第81-82页 |
| ·RT-PCR 检测m-vps 基因在大菱鲆肌肉组织中的表达 | 第81页 |
| ·Western-blot 检测m-vps 基因在大菱鲆肌肉组织中的表达 | 第81-82页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-vps 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第82-83页 |
| ·免疫大菱鲆血清效价水平的检测 | 第83-84页 |
| 3. 讨论 | 第84-86页 |
| 第二章 副溶血弧菌热稳定直接溶血素基因(TDH2)在大肠杆菌中的表达、纯化、定点突变及其 DNA 疫苗的研制 | 第86-101页 |
| 1. 实验方法 | 第86-92页 |
| ·副溶血弧菌FYZ8621.4 热稳定直接溶血素基因(tdh2)的原核表达 | 第86-88页 |
| ·原核表达质粒的构建及鉴定 | 第86-88页 |
| ·引物设计及合成 | 第86-87页 |
| ·副溶血弧菌FYZ8621.4tdh2 基因的PCR 扩增及pMD 19-TSimple/tdh2 克隆质粒的构建 | 第87页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第87页 |
| ·表达质粒的转化 | 第87页 |
| ·质粒DNA 提取及鉴定 | 第87-88页 |
| ·原核表达质粒的构建 | 第88页 |
| ·原核表达质粒的转化及鉴定 | 第88页 |
| ·热稳定直接溶血素基因tdh2 在大肠杆菌中的表达 | 第88页 |
| ·原核表达质粒pET-28a(+)/tdh2 在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达 | 第88页 |
| ·热稳定直接溶血素基因tdh2 表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测 | 第88页 |
| ·重组热稳定直接溶血素TDH2 的纯化 | 第88-89页 |
| ·重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)/tdh2 的诱导及培养 | 第88-89页 |
| ·从菌体中纯化热稳定直接溶血素TDH2 | 第89页 |
| ·Ni 琼脂糖亲和柱亲和层析纯化蛋白 | 第89页 |
| ·PCR 定点突变研究热稳定直接溶血素的活性位点 | 第89-90页 |
| ·以pMD19-T Simple/tdh2 质粒为模板的定点突变 | 第89-90页 |
| ·突变位点的选取 | 第89页 |
| ·突变引物的设计和合成 | 第89-90页 |
| ·利用PCR 以pMD19-T Simple/tdh2 为模板对 tdh2 基因进行定点突变 | 第90页 |
| ·突变质粒的转化 | 第90页 |
| ·突变质粒的鉴定 | 第90页 |
| ·突变蛋白TDH2 的表达及纯化 | 第90页 |
| ·突变热稳定直接溶血素TDH2 的溶血性的检测 | 第90页 |
| ·突变热稳定直接溶血素基因m-tdh2 的真核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第90-91页 |
| ·引物设计及合成 | 第90-91页 |
| ·真核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第91页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-tdh2 对大菱鲆免疫效果的研究 | 第91-92页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-tdh2 的大量提取 | 第91页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第91页 |
| ·实验动物处理及免疫 | 第91页 |
| ·RT-PCR 检测突变的热稳定直接溶血素基因m-tdh2 在大菱鲆体内的表达 | 第91-92页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-tdh2 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第92页 |
| ·免疫大菱鲆血清中抗体水平测定 | 第92页 |
| 2 结果与分析 | 第92-99页 |
| ·副溶血弧菌FYZ8621.4 热稳定直接溶血素基因tdh2 在大肠杆菌中表达 | 第92-95页 |
| ·热稳定直接溶血素基因tdh2 克隆及序列分析 | 第92-94页 |
| ·pET-28a(+)/tdh2 表达质粒的构建、鉴定以及表达 | 第94-95页 |
| ·从菌体中纯化TDH2 | 第95页 |
| ·定点突变热稳定直接溶血素TDH2 的活性位点 | 第95-96页 |
| ·以pMD19-T Simple/tdh2 质粒为模板 PCR 定点突变 TDH2 活性位点 | 第95页 |
| ·突变的热稳定直接溶血素TDH2 的溶血性实验 | 第95-96页 |
| ·副溶血弧菌FYZ8621.4TDH2 的突变基因m-tdh2 真核表达质粒的构建及鉴定 | 第96-97页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-tdh2 对大菱鲆的免疫效果研究 | 第97-99页 |
| ·提取的重组质粒的纯度检测 | 第97页 |
| ·RT-PCR 检测m-tdh2 基因在大菱鲆肌肉组织中的表达 | 第97-98页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-tdh2 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第98页 |
| ·免疫大菱鲆血清效价水平的检测 | 第98-99页 |
| 3 讨论 | 第99-101页 |
| 第三章 副溶血弧菌 TDH2-VPS 二价 DNA 疫苗的研制 | 第101-115页 |
| 1. 实验方法 | 第101-106页 |
| ·副溶血弧菌tdh2-vps 融合基因的原核表达 | 第101-103页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建及鉴定 | 第101-102页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建 | 第101-102页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第102页 |
| ·融合基因tdh2-vps 原核表达质粒的转化 | 第102页 |
| ·融合基因tdh2-vps 原核表达质粒的鉴定 | 第102页 |
| ·融合基因tdh2-vps 在大肠杆菌中的表达 | 第102-103页 |
| ·诱导表达融合基因tdh2-vps | 第102页 |
| ·融合基因tdh2-vps 表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测 | 第102页 |
| ·融合基因tdh2-vps 表达蛋白的Western-blot 检测 | 第102-103页 |
| ·重组融合蛋白的纯化 | 第103页 |
| ·重组融合蛋白的活性研究 | 第103页 |
| ·融合蛋白的溶血活性和水解卵磷脂的活性实验 | 第103页 |
| ·融合蛋白对斑马鱼的毒性实验 | 第103页 |
| ·副溶血弧菌tdh2-vps 融合基因真核表达质粒的构建及鉴定 | 第103-104页 |
| ·融合基因真核表达质粒的构建 | 第103-104页 |
| ·引物设计及合成 | 第103页 |
| ·融合基因真核表达质粒的构建 | 第103-104页 |
| ·融合基因真核表达质粒的鉴定 | 第104页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1 | 第104-106页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-vps 的大量提取 | 第104页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第104页 |
| ·实验动物处理及免疫 | 第104页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-vps在大菱鲆体内的表达及表达产物的检测 | 第104-105页 |
| ·RT-PCR 检测融合基因tdh2-vps 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第104-105页 |
| ·Western-blot 检测融合基因tdh2-vps 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第105页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-vps 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第105-106页 |
| ·免疫大菱鲆血清中抗体水平测定 | 第106页 |
| 2 结果与分析 | 第106-113页 |
| ·融合基因tdh2-vps 在大肠杆菌中的表达 | 第106-109页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建及鉴定 | 第106-107页 |
| ·融合基因tdh2-vps 在大肠杆菌中的表达 | 第107-108页 |
| ·从菌体中纯化重组的融合蛋白 | 第108页 |
| ·重组融合蛋白的活性 | 第108-109页 |
| ·重组融合蛋白的溶血性和水解卵磷脂的活性 | 第108页 |
| ·重组融合蛋白对斑马鱼的毒性 | 第108-109页 |
| ·副溶血弧菌tdh2-vps 融合基因真核表达质粒的构建及鉴定 | 第109-110页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-vps 对大菱鲆免疫效果的研究 | 第110-113页 |
| ·提取的融合基因重组质粒的浓度和纯度检测 | 第110页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-vps在大菱鲆肌肉内表达产物的检测 | 第110-111页 |
| ·RT-PCR 检测融合基因tdh2-vps 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第110-111页 |
| ·Western-blot 检测融合基因tdh2-vps 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第111页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1 | 第111-112页 |
| ·免疫大菱鲆血清效价水平的检测 | 第112-113页 |
| 3. 讨论 | 第113-115页 |
| 第四章 副溶血弧菌 TDH2 基因与哈维氏弧菌 OPPA 基因二联DNA疫苗的研制 | 第115-129页 |
| 1. 实验方法 | 第115-120页 |
| ·tdh2-oppA 融合基因的原核表达 | 第115-117页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建及鉴定 | 第115-116页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建 | 第115-116页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第116页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 原核表达质粒的转化 | 第116页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 原核表达质粒的鉴定 | 第116页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 在大肠杆菌中的表达 | 第116-117页 |
| ·诱导表达融合基因tdh2-oppA | 第116-117页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测 | 第117页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 表达蛋白的Western-blot 检测 | 第117页 |
| ·重组融合蛋白的纯化 | 第117页 |
| ·融合蛋白对斑马鱼的毒性实验 | 第117页 |
| ·tdh2-oppA 融合基因真核表达质粒的构建及鉴定 | 第117-118页 |
| ·融合基因真核表达质粒的构建 | 第117-118页 |
| ·引物设计及合成 | 第117-118页 |
| ·融合基因真核表达质粒的构建 | 第118页 |
| ·融合基因真核表达质粒的鉴定 | 第118页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-oppA 对大菱鲆免疫效果的研究 | 第118-120页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-oppA 的大量提取 | 第118页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第118页 |
| ·实验动物处理及免疫 | 第118页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-oppA 在大菱鲆肌肉内表达产物的检测 | 第118-119页 |
| ·RT-PCR 检测融合基因tdh2-oppA 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第118-119页 |
| ·Western-blot 检测融合基因tdh2-oppA 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第119页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-oppA 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第119-120页 |
| ·免疫大菱鲆血清中抗体水平测定 | 第120页 |
| 2 结果与分析 | 第120-127页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 在大肠杆菌中的表达 | 第120-122页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建及鉴定 | 第120-121页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第121-122页 |
| ·融合蛋白对斑马鱼的毒性实验 | 第122页 |
| ·融合基因tdh2-oppA 真核表达质粒的构建及鉴定 | 第122-123页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-oppA 对大菱鲆免疫效果的研究 | 第123-127页 |
| ·提取的融合基因重组质粒的浓度和纯度检测 | 第123-124页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-oppA 在大菱鲆肌肉内表达产物的检测 | 第124-125页 |
| ·RT-PCR 检测融合基因tdh2-oppA 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第124页 |
| ·Western-blot 检测融合基因tdh2-oppA 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第124-125页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N11/tdh2-oppA 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第125-126页 |
| ·免疫大菱鲆血清效价水平的检测 | 第126-127页 |
| 3. 讨论 | 第127-129页 |
| 第五章 副溶血弧菌 TDH2 基因与鰻弧菌弧菌 OMPU 基因二联DNA疫苗的研制 | 第129-142页 |
| 1. 实验方法 | 第129-134页 |
| ·tdh2-ompU 融合基因的原核表达 | 第129-131页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建及鉴定 | 第129-130页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建 | 第129-130页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第130页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 原核表达质粒的转化 | 第130页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 原核表达质粒的鉴定 | 第130页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 在大肠杆菌中的表达 | 第130-131页 |
| ·诱导表达融合基因tdh2-ompU | 第130页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测 | 第130页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 表达蛋白的Western-blot 检测 | 第130页 |
| ·重组融合蛋白的纯化 | 第130-131页 |
| ·融合蛋白对斑马鱼的致病性实验 | 第131页 |
| ·tdh2-ompU 融合基因真核表达质粒的构建及鉴定 | 第131页 |
| ·融合基因真核表达质粒的构建 | 第131页 |
| ·引物设计及合成 | 第131页 |
| ·融合基因真核表达质粒的构建 | 第131页 |
| ·融合基因真核表达质粒的鉴定 | 第131页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-ompU 对大菱鲆免疫效果的研究 | 第131-134页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-ompU 的大量提取 | 第131-132页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第132页 |
| ·实验动物处理及免疫 | 第132页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-ompU 在大菱鲆肌肉内表达产物的检测 | 第132-133页 |
| ·RT-PCR 检测融合基因tdh2-ompU 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第132-133页 |
| ·Western-blot 检测融合基因tdh2-ompU 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第133页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-ompU 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第133页 |
| ·免疫大菱鲆血清中抗体水平测定 | 第133-134页 |
| 2 结果与分析 | 第134-140页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 在大肠杆菌中的表达 | 第134-136页 |
| ·融合基因原核表达质粒的构建及鉴定 | 第134页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 在大肠杆菌中的表达 | 第134-135页 |
| ·从菌体中纯化重组的融合蛋白 | 第135-136页 |
| ·融合蛋白对斑马鱼的致病性实验 | 第136页 |
| ·融合基因tdh2-ompU 真核表达质粒的构建及鉴定 | 第136-137页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-ompU 对大菱鲆免疫效果的研究 | 第137-140页 |
| ·提取的融合基因重组质粒的浓度和纯度检测 | 第137页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-ompU 在大菱鲆肌肉内表达产物的检测 | 第137-138页 |
| ·RT-PCR 检测融合基因tdh2-ompU 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第137-138页 |
| ·Western-blot 检测融合基因tdh2-ompU 在大菱鲆肌肉内的表达 | 第138页 |
| ·融合基因真核表达质粒pEGFP-N1/tdh2-ompU 对大菱鲆的免疫保护效果 | 第138-139页 |
| ·免疫大菱鲆血清效价水平的检测 | 第139-140页 |
| 3. 讨论 | 第140-142页 |
| 结论 | 第142-144页 |
| 参考文献 | 第144-155页 |
| 附录Ⅰ 溶液配方 | 第155-158页 |
| CACL2 溶液 1.1 G CACL2；90 ML 双蒸水；过滤除菌 | 第155-158页 |
| 附录Ⅱ 已发表和投稿的学术论文 | 第158-159页 |
| 致谢 | 第159页 |
