| 致谢 | 第4-9页 |
| 摘要 | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-19页 |
| 1.1 miRNAs简介及其在乳腺炎症反应中作用的研究进展 | 第10-11页 |
| 1.1.1 微小RNA | 第10页 |
| 1.1.2 miRNAs的生物合成及作用机制 | 第10页 |
| 1.1.3 miRNAs在乳腺炎症反应/免疫防御过程中的调节作用的研究进展 | 第10-11页 |
| 1.2 LPS引起大肠杆菌型乳房炎的信号转导通路的研究 | 第11-16页 |
| 1.2.1 LPS作用的信号转导通路 | 第12-13页 |
| 1.2.2 LPS/TLR4信号通路中相关分子的研究 | 第13-16页 |
| 1.2.2.1 Toll-like receptor 4 | 第13-14页 |
| 1.2.2.2 髓样分化因子 88 | 第14页 |
| 1.2.2.3 白细胞介素-6 | 第14页 |
| 1.2.2.4 核转录因子NF-кB | 第14-15页 |
| 1.2.2.5 白细胞介素-1β | 第15页 |
| 1.2.2.6 肿瘤坏死因子-α | 第15-16页 |
| 1.3 miRNAs参与Toll样受体信号通路的负性调控 | 第16页 |
| 1.4 miRNAs表达载体构建的研究 | 第16-18页 |
| 1.4.1 新型载体Minicircle | 第17页 |
| 1.4.2 Piggy Bac转座子 | 第17-18页 |
| 1.5 展望 | 第18-19页 |
| 2 引言 | 第19-20页 |
| 3 材料与方法 | 第20-34页 |
| 3.1 试验材料 | 第20页 |
| 3.1.1 细胞 | 第20页 |
| 3.1.2 菌株和质粒 | 第20页 |
| 3.2 主要试剂 | 第20页 |
| 3.3 试验仪器 | 第20页 |
| 3.4 试剂配制 | 第20-22页 |
| 3.4.1 常规生化试剂 | 第20-21页 |
| 3.4.2 蛋白电泳试剂 | 第21页 |
| 3.4.3 Western blot试剂 | 第21-22页 |
| 3.5 miRNAs在LPS诱导EpH4-Ev细胞炎性反应中的表达 | 第22-24页 |
| 3.5.1 EpH4-Ev细胞的稳定培养 | 第22页 |
| 3.5.2 细胞处理及分组 | 第22页 |
| 3.5.3 总RNA提取 | 第22页 |
| 3.5.4 总RNA浓度的检测 | 第22页 |
| 3.5.5 c DNA合成 | 第22-23页 |
| 3.5.6 q RT-PCR的引物设计与合成 | 第23页 |
| 3.5.7 q RT-PCR检测miRNAs表达 | 第23-24页 |
| 3.5.8 数据处理 | 第24页 |
| 3.6 微环Mini-miR-223、PB-miR-223 和pcD-miR-223 真核表达载体的构建 | 第24-28页 |
| 3.6.1 小鼠基因组DNA的提取 | 第24-25页 |
| 3.6.1.1 试剂准备 | 第24页 |
| 3.6.1.2 EpH4-Ev细胞基因组DNA的抽提 | 第24-25页 |
| 3.6.2 pre-miR-223 引物设计与合成 | 第25页 |
| 3.6.3 pre-miR-223 基因PCR扩增及鉴定 | 第25页 |
| 3.6.4 目的片段切胶回收 | 第25页 |
| 3.6.5 双酶切PCR产物和Minicircle、PB及pc DNA3.1(＋)质粒 | 第25-26页 |
| 3.6.6 酶切产物纯化 | 第26页 |
| 3.6.7 连接Minicircle、PB及pc DNA3.1(+)载体 | 第26-27页 |
| 3.6.8 连接产物转化感受态细胞 | 第27页 |
| 3.6.9 阳性克隆菌的筛选与鉴定 | 第27-28页 |
| 3.7 miR-223 重组质粒在Ep H4-Ev细胞中的表达 | 第28-29页 |
| 3.7.1 Mini-miR-223 微环的诱导及鉴定 | 第28页 |
| 3.7.2 重组质粒中提 | 第28页 |
| 3.7.3 转染至Ep H4-Ev细胞 | 第28-29页 |
| 3.7.4 PB-miR-223 稳定细胞系的筛选 | 第29页 |
| 3.7.5 miR-223 基因过表达的检测 | 第29页 |
| 3.7.5.1 细胞总RNA提取及检测 | 第29页 |
| 3.7.5.2 cDNA合成 | 第29页 |
| 3.7.5.3 qRT-PCR检测miR-223基因 | 第29页 |
| 3.7.5.4 数据处理 | 第29页 |
| 3.8 miR-223inhibitor靶向抑制miR-223 基因的表达 | 第29-30页 |
| 3.8.1 miR-223 抑制剂的合成 | 第29页 |
| 3.8.2 试验分组及转染 | 第29-30页 |
| 3.8.3 总RNA提取及浓度测定 | 第30页 |
| 3.8.4 cDNA合成 | 第30页 |
| 3.8.5 qRT-PCR检测miR-223 基因 | 第30页 |
| 3.8.6 数据处理 | 第30页 |
| 3.9 miR-223 对LPS/TLR4信号通路的影响 | 第30-32页 |
| 3.9.1 LPS对TLR4信号通路中相关分子的影响 | 第30-31页 |
| 3.9.1.1 引物设计 | 第30页 |
| 3.9.1.2 细胞分组及处理 | 第30-31页 |
| 3.9.1.3 RNA提取及浓度测定 | 第31页 |
| 3.9.1.4 反转录成cDNA | 第31页 |
| 3.9.1.5 qRT-PCR检测TLR信号通路中相关分子的表达 | 第31页 |
| 3.9.1.6 数据分析 | 第31页 |
| 3.9.2 miR-223 基因对LPS/TLR4信号通路的影响 | 第31-32页 |
| 3.9.2.1 细胞分组及处理 | 第31-32页 |
| 3.9.2.2 总RNA提取及浓度测定 | 第32页 |
| 3.9.2.3 反转录成c DNA | 第32页 |
| 3.9.2.4 qRT-PCR检测EpH4-Ev细胞中炎性细胞因子的表达 | 第32页 |
| 3.9.2.5 数据分析 | 第32页 |
| 3.10 Western blot分析 | 第32-34页 |
| 3.10.1 蛋白样品的准备 | 第32页 |
| 3.10.2 电泳 | 第32-34页 |
| 4 结果与分析 | 第34-43页 |
| 4.1 miRNAs在LPS诱导EpH4-Ev细胞炎性反应中的表达 | 第34-35页 |
| 4.1.1 miRNAs在LPS诱导EpH4-Ev细胞 48 h时的表达变化 | 第34-35页 |
| 4.2 微环Mini -miR-223、PB- miR-223 和pc D-miR-223 真核表达载体的构建 | 第35-38页 |
| 4.2.1 pre-miR-223 基因扩增 | 第35页 |
| 4.2.2 PCR鉴定阳性重组质粒 | 第35-36页 |
| 4.2.3 miR-223 真核表达载体在EpH4-Ev细胞中表达 | 第36-37页 |
| 4.2.3.1 单酶切鉴定诱导的Mini-miR-223 微环 | 第36页 |
| 4.2.3.2 筛选建立稳定过表达PB-miR-223 的EpH4-Ev细胞系 | 第36-37页 |
| 4.2.4 miR-223 基因过表达 | 第37-38页 |
| 4.3 miR-223 inhibitor靶向抑制miR-223 的表达 | 第38-39页 |
| 4.3.1 测定miR-223inhibitor抑制miR-223 表达的最佳浓度 | 第38-39页 |
| 4.4 miR-223 对TLR4信号通路的影响 | 第39-42页 |
| 4.4.1 LPS对TLR4信号通路中相关分子的影响 | 第39-40页 |
| 4.4.2 miR-223 基因对LPS/TLR4信号通路的影响 | 第40-42页 |
| 4.5 Western blot分析 | 第42-43页 |
| 4.5.1 Western blot检测miR-223 基因对目的蛋白表达水平的影响 | 第42-43页 |
| 5 讨论与结论 | 第43-46页 |
| 5.1 讨论 | 第43-45页 |
| 5.1.1 炎性相关miRNAs在LPS诱导Ep H4-Ev细胞炎性反应中的表达 | 第43页 |
| 5.1.2 miR-223 真核表达载体的应用 | 第43-44页 |
| 5.1.3 miR-223 基因在Ep H4-Ev细胞中的表达 | 第44页 |
| 5.1.4 miR-223 基因对LPS介导的TLR4信号通路的影响 | 第44-45页 |
| 5.2 结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-55页 |
| 英文摘要 | 第55-56页 |
