| 中文摘要 | 第4-8页 |
| Abstract | 第8-12页 |
| 缩略词表 | 第19-21页 |
| 综述 外源蛋白在大肠杆菌表达系统高产量、可溶性表达调控策略 | 第21-37页 |
| 参考文献 | 第30-37页 |
| 前言 | 第37-42页 |
| 第一章 Tat碱性多肽促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达的研究 | 第42-64页 |
| 第一节 不同分子量蛋白原核表达载体的构建及鉴定 | 第42-54页 |
| 1 材料与方法 | 第42-48页 |
| 1.1 材料 | 第42-43页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第42页 |
| 1.1.2 设备与试剂 | 第42-43页 |
| 1.2 方法 | 第43-48页 |
| 1.2.1 N2株系秀丽线虫的培养及总RNA制备 | 第43页 |
| 1.2.2 酵母菌GS115的培养及总RNA制备 | 第43-44页 |
| 1.2.3 RT-PCR扩增目的基因 | 第44-45页 |
| 1.2.4 凝胶回收 | 第45-46页 |
| 1.2.5 限制性内切酶双酶切 | 第46页 |
| 1.2.6 连接 | 第46-47页 |
| 1.2.7 转化 | 第47页 |
| 1.2.8 菌液PCR验证 | 第47-48页 |
| 2 结果 | 第48-53页 |
| 2.1 原核表达载体的构建 | 第48-50页 |
| 2.2 验证结果与预期结果一致 | 第50-53页 |
| 3 结论 | 第53-54页 |
| 第二节 Tat碱性蛋白促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达的研究 | 第54-64页 |
| 1 材料与方法 | 第54-55页 |
| 1.1 设备与试剂 | 第54页 |
| 1.2 方法 | 第54-55页 |
| 1.2.1 不同分子量外源蛋白的诱导表达 | 第54页 |
| 1.2.2 SDS-PAGE检测 | 第54-55页 |
| 1.2.3 数据处理及统计学分析 | 第55页 |
| 2 结果 | 第55-63页 |
| 2.1 Tat碱性多肽显著促进超小分子量外源蛋白MTL-1、MTL-2高产量可溶性表达 | 第55-57页 |
| 2.2 Tat碱性多肽显著促进小分子量外源蛋白SOD-1、SOD-2高产量可溶性表达 | 第57-59页 |
| 2.3 Tat碱性多肽显著促进中分子量外源蛋白GPD-3、GAP-3可溶性表达 | 第59-61页 |
| 2.4 Tat碱性多肽显著抑制大分子量外源蛋白DAF-16、HSP-70蛋白表达 | 第61-63页 |
| 3 结论 | 第63-64页 |
| 第二章 Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量可溶性表达的潜在作用机理研究 | 第64-90页 |
| 第一节 Tat碱性多肽促进SOD系列蛋白高产量、可溶性表达 | 第64-79页 |
| 1 材料与方法 | 第64-72页 |
| 1.1 材料 | 第64-65页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第64页 |
| 1.1.2 设备与试剂 | 第64-65页 |
| 1.2 方法 | 第65-72页 |
| 1.2.1 大肠杆菌BL21(DE3)的培养及总RNA制备 | 第65-66页 |
| 1.2.2 RT-PCR扩增目的基因 | 第66-67页 |
| 1.2.3 凝胶回收 | 第67-68页 |
| 1.2.4 限制性内切酶双酶切 | 第68页 |
| 1.2.5 连接 | 第68-69页 |
| 1.2.6 转化 | 第69页 |
| 1.2.7 质粒提取及双酶切鉴定 | 第69页 |
| 1.2.8 蛋白诱导表达 | 第69页 |
| 1.2.9 SDS-PAGE检测 | 第69-70页 |
| 1.2.10 Western blot检测 | 第70页 |
| 1.2.11 过表达SOD系列蛋白菌液的总蛋白提取 | 第70-71页 |
| 1.2.12 过表达SOD系列蛋白菌液的超氧化物歧化酶活性测定 | 第71页 |
| 1.2.13 过表达SOD系列蛋白菌液的抗PQ活性测定 | 第71-72页 |
| 1.2.14 大肠杆菌MG1655及SOD突变株系菌体抗PQ活性测定 | 第72页 |
| 2 结果 | 第72-78页 |
| 2.1 大肠杆菌SOD系列原核表达载体构建 | 第72-75页 |
| 2.2 Tat碱性多肽促进大肠杆菌SOD系列蛋白高产量、可溶性表达 | 第75-76页 |
| 2.3 过表达Tat标签蛋白菌液的超氧化物歧化酶活性显著高于非Tat标签蛋白 | 第76-77页 |
| 2.4 过表达Tat标签蛋白菌液的抗PQ活性显著高于非Tat标签蛋白 | 第77-78页 |
| 3 结论 | 第78-79页 |
| 第二节 Tat碱性多肽通过增加MRNA表达水平促进外源蛋白高产量、可溶性表达 | 第79-84页 |
| 1 材料与方法 | 第79-82页 |
| 1.1 材料 | 第79页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第79页 |
| 1.1.2 设备与试剂 | 第79页 |
| 1.2 方法 | 第79-82页 |
| 1.2.1 蛋白诱导表达 | 第79-80页 |
| 1.2.2 过表达Tat标签蛋白与非Tat标签蛋白的大肠杆菌总RNA提取 | 第80页 |
| 1.2.3 反转录 | 第80-81页 |
| 1.2.4 实时定量PCR | 第81-82页 |
| 1.2.5 数据处理及统计分析 | 第82页 |
| 2 结果 | 第82-83页 |
| 2.1 Tat碱性多肽通过促进m RNA表达水平促进外源蛋白高产量、可溶性表达 | 第82-83页 |
| 3 结论 | 第83-84页 |
| 第三节 Tat碱性多肽对融合表达蛋白二级结构的影响 | 第84-90页 |
| 1 材料与方法 | 第84-85页 |
| 1.1 材料 | 第84页 |
| 1.1.1 设备与试剂 | 第84页 |
| 1.2 方法 | 第84-85页 |
| 1.2.1 Tat标签蛋白与非Tat标签蛋白的分离纯化 | 第84页 |
| 1.2.2 SDS-PAGE检测 | 第84-85页 |
| 1.2.3 Tat标签蛋白与非Tat标签蛋白的脱盐浓缩 | 第85页 |
| 1.2.5 数据处理及统计分析 | 第85页 |
| 2 结果 | 第85-88页 |
| 2.1 SOD系列蛋白的分离纯化及SDS-PAGE检测 | 第85-86页 |
| 2.2 含Tat碱性多肽的蛋白 α 螺旋比例显著增加 | 第86-87页 |
| 2.3 含Tat碱性多肽的蛋白 β 转角折叠比例显著降低 | 第87页 |
| 2.4 含Tat碱性多肽的蛋白 β 转角比例显著增加 | 第87-88页 |
| 2.5 含Tat碱性多肽的蛋白无规则卷曲比例没有规律性变化 | 第88页 |
| 3 结论 | 第88-90页 |
| 第三章 Tat碱性多肽促进外源蛋白 4℃高产量表达的研究 | 第90-106页 |
| 第一节 大肠杆菌原核表达载体的构建及鉴定 | 第90-98页 |
| 1 材料与方法 | 第90-95页 |
| 1.1 材料 | 第90页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第90页 |
| 1.1.2 设备与试剂 | 第90页 |
| 1.2 方法 | 第90-95页 |
| 1.2.1 大肠杆菌BL21(DE3)的培养及总RNA制备 | 第90-91页 |
| 1.2.2 RT-PCR扩增绿色荧光蛋白及脑红蛋白 | 第91-93页 |
| 1.2.3 凝胶回收 | 第93页 |
| 1.2.4 限制性内切酶双酶切 | 第93-94页 |
| 1.2.5 连接 | 第94页 |
| 1.2.6 转化 | 第94页 |
| 1.2.7 菌液PCR及测序验证 | 第94-95页 |
| 2 结果 | 第95-97页 |
| 2.1 成功构建大肠杆菌绿色荧光蛋白和脑红蛋白表达载体 | 第95-96页 |
| 2.2 测序结果与预期结果一致 | 第96-97页 |
| 3 结论 | 第97-98页 |
| 第二节 Tat碱性多肽促进外源蛋白 4℃高产量表达的研究 | 第98-106页 |
| 1 材料与方法 | 第98-100页 |
| 1.1 设备与试剂 | 第98页 |
| 1.2 方法 | 第98-100页 |
| 1.2.1 4℃低温条件下蛋白诱导表达 | 第98-99页 |
| 1.2.2 SDS-PAGE检测 | 第99页 |
| 1.2.3 Western blot检测 | 第99-100页 |
| 1.2.4 4℃低温条件菌液单克隆培养 | 第100页 |
| 1.2.5 荧光显微镜检测 | 第100页 |
| 1.2.6 数据处理及统计学分析 | 第100页 |
| 2 结果 | 第100-104页 |
| 2.1 Tat碱性多肽促进外源蛋白EGFP和NGB 4℃高产量表达 | 第100-102页 |
| 2.2 随着诱导时间增加，Tat碱性多肽促进 4℃外源蛋白表达效率越显著 | 第102-104页 |
| 2.3 在不含IPTG诱导剂条件下，Tat碱性多肽促进 4℃外源蛋白泄露表达 | 第104页 |
| 3 结论 | 第104-106页 |
| 讨论 | 第106-112页 |
| 参考文献 | 第112-124页 |
| 附录 | 第124-128页 |
| 攻读学位期间发表文章情况 | 第128-130页 |
| 致谢 | 第130页 |
