| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-5页 |
| 中文文摘 | 第5-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 第1章 绪论 | 第12-26页 |
| ·高产乙醇酿酒酵母的分子选育是燃料乙醇产业化的关键 | 第12-17页 |
| ·燃料乙醇是解决能源危机的理想替代品 | 第12页 |
| ·酿酒酵母是生产燃料乙醇的理想菌株 | 第12-14页 |
| ·酿酒酵母分子育种的国内外研究进展 | 第14-17页 |
| ·拓展底物范围 | 第14-16页 |
| ·降低副产物的生成率,提高乙醇产量 | 第16页 |
| ·改良细胞特性 | 第16-17页 |
| ·酿酒酵母乙醇脱氢酶的研究 | 第17-20页 |
| ·乙醇脱氢酶 Ⅰ(adh1) | 第18页 |
| ·乙醇脱氢酶 Ⅱ(adh2) | 第18-19页 |
| ·乙醇脱氢酶 Ⅲ(adh3) | 第19页 |
| ·乙醇脱氢酶 Ⅳ(adh4) | 第19页 |
| ·乙醇脱氢酶 Ⅴ(sfa1) | 第19-20页 |
| ·乙醇脱氢酶 Ⅵ(adh6) | 第20页 |
| ·乙醇脱氢酶 Ⅶ(adh7) | 第20页 |
| ·基因超表达和敲除技术是现代工业微生物育种的有效手段 | 第20-22页 |
| ·Cre/loxP系统介导的位点特异性重组技术 | 第22-25页 |
| ·Cre/loxP体系的重组原理 | 第22-23页 |
| ·Cre/lox P系统在酿酒酵母中的应用 | 第23-25页 |
| ·特定基因的敲除 | 第23-24页 |
| ·整合表达载体中选择性标记的切除 | 第24-25页 |
| ·本研究目的意义 | 第25-26页 |
| 第2章 材料与方法 | 第26-38页 |
| ·实验材料 | 第26-30页 |
| ·菌株与质粒 | 第26页 |
| ·培养基 | 第26-27页 |
| ·试剂与溶液的配制 | 第27-29页 |
| ·寡聚核苷酸引物 | 第29页 |
| ·工具酶 | 第29页 |
| ·其它试剂 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| ·实验方法 | 第30-38页 |
| ·冷冻干燥菌种的恢复培养 | 第30-31页 |
| ·安瓿管开封 | 第30页 |
| ·菌株恢复培养 | 第30-31页 |
| ·快速分离酵母DNA的方法 | 第31页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·质粒pUG6和pSH65的转化 | 第32页 |
| ·碱裂解法制备pUG6和pSH65质粒DNA | 第32-33页 |
| ·乙醇沉淀DNA | 第33页 |
| ·平板影印法 | 第33-34页 |
| ·LiAc/SS载体DNA/PEG高效酵母转化法 | 第34-35页 |
| ·实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测adh1基因超表达 | 第35-38页 |
| ·酿酒酵母总RNA的提取 | 第35-36页 |
| ·Reverse Transcription PCR | 第36页 |
| ·Real-time PCR引物设计 | 第36页 |
| ·18S rRNA基因和adh1基因的PCR鉴定 | 第36页 |
| ·荧光定量PCR检测adh1基因 | 第36-38页 |
| 第3章 结果与分析 | 第38-66页 |
| ·酿酒酵母总DNA的提取 | 第38页 |
| ·重叠延伸PCR法获得PGK启动子和adh1基因融合片段 | 第38-45页 |
| ·巢式PCR获PGK启动子片段 | 第39-40页 |
| ·PGK启动子测序验证 | 第40-42页 |
| ·巢式PCR获adh1基因片段 | 第42-44页 |
| ·重叠延伸PCR | 第44-45页 |
| ·CYC1终止子的扩增 | 第45-46页 |
| ·整合表达载体pUPGKAT的构建 | 第46-56页 |
| ·质粒pUG6和pSH65的扩增和鉴定 | 第46-50页 |
| ·质粒pUG6的扩增 | 第46-47页 |
| ·质粒pUG6的酶切验证 | 第47-48页 |
| ·质粒pSH65的扩增 | 第48-49页 |
| ·质粒pSH65的酶切验证 | 第49-50页 |
| ·pTAF载体的构建 | 第50-53页 |
| ·pTAT载体的构建 | 第53页 |
| ·pUPGKA载体的构建 | 第53-54页 |
| ·载体pUPGKA的酶切验证 | 第54-55页 |
| ·重组表达载体pUPGKAT的构建 | 第55-56页 |
| ·adh1基因的超表达 | 第56-59页 |
| ·质粒pUPGKAT的线性化 | 第56-57页 |
| ·线性化质粒pUPGKAT的转化 | 第57-58页 |
| ·重组子的菌落PCR验证 | 第58-59页 |
| ·筛选标记的切除 | 第59-60页 |
| ·荧光定量PCR检测adh1基因的超表达 | 第60-64页 |
| ·18S rRNA基因和adh1基因的PCR鉴定 | 第60-61页 |
| ·相对定量标准曲线的建立 | 第61-62页 |
| ·熔解曲线分析 | 第62-63页 |
| ·基因表达相对差异分析 | 第63-64页 |
| ·突变株生长试验测定 | 第64页 |
| ·生长试验测定 | 第64页 |
| ·突变株遗传稳定性试验检测 | 第64页 |
| ·突变株发酵乙醇代谢测定 | 第64-66页 |
| 第4章 讨论 | 第66-68页 |
| 结论 | 第68-70页 |
| 附录 | 第70-74页 |
| 参考文献 | 第74-84页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第84-86页 |
| 致谢 | 第86-88页 |
| 个人简历 | 第88-90页 |
