| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-16页 |
| 前言 | 第16-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-54页 |
| 第一章 单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力因子 | 第19-32页 |
| 1 黏附侵袭相关毒力因子 | 第20-23页 |
| ·内化素(Internalins) | 第20-21页 |
| ·酰胺酶(Ami) | 第21页 |
| ·细胞壁水解酶(p60) | 第21-22页 |
| ·纤连蛋白结合蛋白A(FbpA) | 第22页 |
| ·李斯特菌溶血素(LLO) | 第22页 |
| ·肌动蛋白聚集因子(ActA) | 第22页 |
| ·白溶素(Auto) | 第22-23页 |
| 2 细胞内感染相关毒力因子 | 第23-24页 |
| ·李斯特菌溶血素(LLO),磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)和卵磷脂酶(PC-PLC) | 第23-24页 |
| ·肌动蛋白聚集因子(ActA) | 第24页 |
| ·己糖磷酸盐转运蛋白(Hpt) | 第24页 |
| 3 毒力调控因子 | 第24-25页 |
| ·转录活化因子(PrfA) | 第24-25页 |
| ·应答调控因子(VirR) | 第25页 |
| 4 其它毒力因子 | 第25-26页 |
| ·分拣酶(Sortase) | 第25-26页 |
| ·胆酸盐水解酶(BSH) | 第26页 |
| 5 总结 | 第26-32页 |
| 第二章 单核细胞增多性李斯特菌的分型技术 | 第32-42页 |
| 1 单增李斯特菌的传统表型分析法 | 第32-33页 |
| ·血清分型(serotyping) | 第32页 |
| ·噬菌体分型(phagetyping) | 第32-33页 |
| ·多区带酶电泳分型(multilocus enzyme electrophoresis,MLEE) | 第33页 |
| ·酯酶分型(esterase typing) | 第33页 |
| 2 单增李斯特菌的分子分型法 | 第33-39页 |
| ·脉冲场凝胶电泳分型(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE) | 第33-34页 |
| ·核糖体分型(ribotyping) | 第34-35页 |
| ·基于PCR的分型技术(PCR-based subtyping techniques) | 第35-38页 |
| ·随机扩增DNA多态性分析分型(RAPD)及随机引物PCR扩增分型(AP-PCR) | 第35-36页 |
| ·扩增片段长度多态性分析分型(AFLP) | 第36页 |
| ·PCR-限制性片段长度多态性分析分型(PCR-RFLP) | 第36-37页 |
| ·重复片段PCR分型(REP-PCR) | 第37页 |
| ·单链构象多态性分析分型(SSCP) | 第37页 |
| ·扩增基因间位点多态性分析分型(AILP) | 第37-38页 |
| ·基于DNA序列的分型技术-多位点序列分型(MLST) | 第38-39页 |
| 3 总结 | 第39-42页 |
| 第三章 单核细胞增多性李斯特菌作为疫苗载体的研究进展 | 第42-54页 |
| 1 单核细胞增多性李斯特菌作为疫苗载体的基础 | 第42-44页 |
| 2 单增李斯特菌的减毒方法 | 第44-45页 |
| ·基于毒力基因的缺失或插入突变 | 第44-45页 |
| ·毒力基因缺失突变 | 第44-45页 |
| ·毒力基因插入突变 | 第45页 |
| ·营养缺陷型突变 | 第45页 |
| 3 表达外源基因重组单增李斯特菌的构建 | 第45-46页 |
| 4 单增李斯特菌作为疫苗载体的应用 | 第46-49页 |
| ·单增李斯特菌作为携带病毒性抗原的载体 | 第47-48页 |
| ·淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV) | 第47页 |
| ·免疫缺陷病毒(HIV或FIV) | 第47-48页 |
| ·人的乳头瘤病毒(HPV) | 第48页 |
| ·单增李斯特菌作为携带寄生虫性抗原的载体 | 第48页 |
| ·作为DNA疫苗的载体 | 第48页 |
| ·在其他肿瘤方面的应用 | 第48页 |
| ·用于其他新型疫苗的研究 | 第48-49页 |
| 5 单增李斯特菌作为疫苗载体的潜在危险性 | 第49-50页 |
| 6 总结 | 第50-54页 |
| 第二部分 实验研究 | 第54-137页 |
| 第一章 单核细胞增多性李斯特菌食品及环境分离株的毒力比较 | 第55-64页 |
| 1 材料和方法 | 第56-58页 |
| ·菌株及培养基 | 第56页 |
| ·试剂 | 第56页 |
| ·实验动物及细胞 | 第56-57页 |
| ·小鼠及鸡胚的LD_(50)试验 | 第57-58页 |
| ·L929细胞的空斑形成试验 | 第58页 |
| 2 结果 | 第58-60页 |
| ·小鼠及鸡胚毒力试验表明大多数单增李斯特菌分离株的毒力与参考菌株10403S相当 | 第58页 |
| ·L929细胞空斑形成试验表明大多数单增李斯特菌分离株为强毒株 | 第58-60页 |
| 3 讨论 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-64页 |
| 第二章 单核细胞增多性李斯特菌食品及环境分离株分型技术研究 | 第64-78页 |
| 1 材料和方法 | 第65-67页 |
| ·菌株,质粒及培养基 | 第65页 |
| ·工具酶和试剂 | 第65-66页 |
| ·actA,InlA和InlB短片段的PCR扩增、克隆和序列分析 | 第66页 |
| ·单增李斯特菌分离株的脉冲场凝胶电泳 | 第66-67页 |
| 2 结果 | 第67-73页 |
| ·单增李斯特菌分离株actA、InlA和InlB的PCR扩增及重组质粒pMD18-T-actA(InlA和InlB)构建 | 第67-68页 |
| ·基于actA的单增李斯特菌序列分型 | 第68-69页 |
| ·基于InlA的单增李斯特菌序列分型 | 第69页 |
| ·基于InlB的单增李斯特菌序列分型 | 第69-70页 |
| ·单增李斯特菌食品及环境分离株的多位点序列分型综合 | 第70-71页 |
| ·单增李斯特菌食品及环境分离株的PFGE分型 | 第71-73页 |
| 3 讨论 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-78页 |
| 第三章 单核细胞增多性李斯特菌奶源分离株H4毒力相关表型与基因分析 | 第78-93页 |
| 1 材料和方法 | 第79-82页 |
| ·菌株,质粒,培养基,试剂和引物 | 第79页 |
| ·实验动物及细胞系 | 第79页 |
| ·鸡胚及小鼠的LD_(50)试验 | 第79-80页 |
| ·溶血价的测定及溶血活性的观察 | 第80-81页 |
| ·体外生长试验 | 第81页 |
| ·L929细胞中的空斑形成试验 | 第81页 |
| ·对细胞的黏附、侵袭力和细胞内增殖试验 | 第81页 |
| ·溶脂活性试验 | 第81-82页 |
| ·主要毒力基因的T-A克隆及序列分析 | 第82页 |
| 2 结果 | 第82-88页 |
| ·小鼠和鸡胚毒力试验表明H4菌株为弱毒株 | 第82-83页 |
| ·毒力相关的表型分析 | 第83-84页 |
| ·单增李斯特菌主要毒力基因的序列分析 | 第84-88页 |
| 3 讨论 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-93页 |
| 第四章 单核细胞增多性李斯特菌奶源分离株H4强溶脂活性的分子基础 | 第93-105页 |
| 1 材料和方法 | 第93-97页 |
| ·菌株,质粒,培养基和引物 | 第93-94页 |
| ·工具酶和试剂(盒) | 第94页 |
| ·细菌DNA抽提 | 第94页 |
| ·同源重组区靶基因片段plcB的PCR扩增及重组质粒pUC18-plcB的构建 | 第94-95页 |
| ·点突变 | 第95-96页 |
| ·重组质粒pKSV7-△plcB1,pKSV7-△plcB2和pKSV7-△plcB3的构建 | 第96页 |
| ·突变株H4-△plcB1,H4-△plcB2和H4-△plcB3的构建与鉴定 | 第96页 |
| ·突变株H4-△plcB1,H4-△plcB2和H4-△plcB3的溶脂活性研究 | 第96-97页 |
| ·突变株H4-△plcB1的小鼠LD_(50)试验 | 第97页 |
| 2 结果 | 第97-102页 |
| ·plcB靶目的片段的PCR扩增及重组质粒pUC18-plcB的鉴定 | 第97-98页 |
| ·重组质粒pKSV7-△plcB1,pKSV7-△plcB2和pKSV7-△plcB3的鉴定 | 第98-99页 |
| ·突变株H4-△plcB1,H4-△plcB2和H4-△plcB3的鉴定 | 第99-101页 |
| ·plcB的-26位和ORF第1位突变为参考菌株10403S的相应碱基后消除了H4菌株的强溶脂活性,且毒力增强 | 第101页 |
| ·plcB的-26位突变为参考菌株10403S的相应碱基后也消除了H4菌株的强溶脂活性 | 第101-102页 |
| 3 讨论 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-105页 |
| 第五章 表达绿色荧光蛋白的重组单核细胞增多性李斯特菌的构建及其生物学特性 | 第105-120页 |
| 1 材料与方法 | 第106-109页 |
| ·材料 | 第106-107页 |
| ·质粒、菌株 | 第106页 |
| ·工具酶 | 第106页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第106页 |
| ·实验动物和细胞 | 第106-107页 |
| ·方法 | 第107-109页 |
| ·细菌DNA抽提 | 第107页 |
| ·引物的设计及合成 | 第107页 |
| ·同源重组区靶基因片段hly的PCR扩增及重组质粒pUC18-△hly的构建 | 第107页 |
| ·重组穿梭质粒pKSV7-△hly-gfp的构建 | 第107-108页 |
| ·重组菌Lm-△hly-gfp的构建 | 第108页 |
| ·RT-PCR扩增重组菌Lm-△hly-gfp的gfp片段 | 第108页 |
| ·重组菌Lm-△hly-gfp的荧光观察 | 第108页 |
| ·HeLa细胞侵袭力试验 | 第108-109页 |
| ·鸡胚和小鼠毒力试验 | 第109页 |
| ·单增李斯特菌Lm-△hly-gfp株溶血活性变化 | 第109页 |
| ·单增李斯特菌Lm-△hly-gfp株的体外生长试验 | 第109页 |
| 2 结果 | 第109-116页 |
| ·Lm溶血素基因hly靶目的片段的PCR扩增及重组质粒pUC18-△hly的构建 | 第109-110页 |
| ·绿色荧光蛋白gfp基因的PCR扩增及重组质粒pUC18-△hly-gfp的构建 | 第110-111页 |
| ·重组质粒pKSV7-△hly-gfp的构建 | 第111-112页 |
| ·重组菌Lm-△hly-gfp的构建与鉴定 | 第112-113页 |
| ·阳性转化子的鉴定 | 第112页 |
| ·目的基因片段gfp实现同源重组,整合到Lm10403S基因组中 | 第112-113页 |
| ·RT-PCR表明gfp能在重组菌Lm-△hly-gfp中转录 | 第113页 |
| ·重组菌Lm-△hly-gfp能表达绿色荧光蛋白GFP | 第113-114页 |
| ·外源基因的整合降低了重组菌Lm-△hly-gfp对Hela细胞的侵袭力及对鸡胚和小鼠的毒力 | 第114-115页 |
| ·重组菌Lm-△hly-gfp丧失了溶血活性 | 第115页 |
| ·重组菌Lm△-hly-gfp与野生型菌株10403S具有相似的体外生长特性 | 第115-116页 |
| 3 讨论 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-120页 |
| 第六章 表达新城疫病毒融合蛋白重组单核细胞增多性李斯特菌的构建及其免疫原性 | 第120-137页 |
| 1 材料和方法 | 第121-125页 |
| ·菌株,质粒及培养基 | 第121页 |
| ·工具酶及主要试剂(盒) | 第121-122页 |
| ·实验动物及细胞 | 第122页 |
| ·细菌DNA抽提 | 第122页 |
| ·基因切割-重叠延伸PCR扩增plcB同源区及重组质粒pUC18-△plcB的构建 | 第122-123页 |
| ·重组穿梭质粒pKSV7-△plcB-Fa的构建 | 第123页 |
| ·重组菌Lm-△plcB-Fa的构建 | 第123页 |
| ·RT-PCR扩增重组菌Lm-△plcB-Fa的Fa片段 | 第123页 |
| ·SDS-PAGE及Westernblot检测重组菌Lm-△plcB-Fa中Fa的表达 | 第123页 |
| ·重组菌Lm-△plcB-Fa的体内外稳定性 | 第123-124页 |
| ·重组菌的体外生长试验 | 第124页 |
| ·重组菌Lm-△plcB-Fa的HeLa细胞侵袭力试验 | 第124页 |
| ·ICR小鼠及鸡胚毒力试验 | 第124页 |
| ·重组菌的SPF鸡免疫保护试验 | 第124-125页 |
| ·试验分组及免疫 | 第124-125页 |
| ·细菌分离 | 第125页 |
| ·采血及间接ELISA法检测抗体效价 | 第125页 |
| ·NDV攻毒 | 第125页 |
| 2 结果 | 第125-133页 |
| ·重组质粒pUC18-△plcB的鉴定 | 第125-126页 |
| ·重组穿梭质粒pKSV7-△plcB-Fa的构建 | 第126-127页 |
| ·重组单增李斯特菌Lm-△plcB-Fa的鉴定 | 第127页 |
| ·RT-PCR表明Fa片段能在重组菌中转录 | 第127-128页 |
| ·重组菌Lm-△plcB-Fa能表达Fa | 第128页 |
| ·重组菌Lm-△plcB-Fa在体内外均稳定,且与野生型菌株具有相似的体外生长特性 | 第128-129页 |
| ·重组菌Lm-△plcB-Fa对HeLa细胞的侵袭率下降,对鸡胚和小鼠的毒力降低 | 第129-130页 |
| ·携带外源基因的重组菌免疫雏鸡的免疫保护性试验 | 第130-133页 |
| 3 讨论 | 第133-135页 |
| 参考文献 | 第135-137页 |
| 结论与展望 | 第137-139页 |
| 附录 常用缓冲液及培养基配方 | 第139-144页 |
| 致谢 | 第144-145页 |
| 攻读博士期间的发表的学术论文 | 第145页 |
