| 目录 | 第1-6页 |
| 致谢 | 第6-7页 |
| 缩写符号说明 | 第7-8页 |
| 中文摘要 | 第8-9页 |
| 英文摘要 | 第9-10页 |
| 第一部分 前言 | 第10-17页 |
| 1． 文献综述 | 第10-17页 |
| 1．1 thaumatin的发现历史及生化特性 | 第10页 |
| 1．2 thaumatin的甜味机理 | 第10-11页 |
| 1．3 thaumatin的生理功能 | 第11-12页 |
| 1．4 thaumatin的基因工程 | 第12-13页 |
| 1．4．1 thaumatin在原核生物中的表达 | 第12页 |
| 1．4．2 thaumatin在真菌中的表达 | 第12-13页 |
| 1．4．3 thaumatin在植物中的表达 | 第13页 |
| 1．5 研究意义 | 第13-14页 |
| 1．6 挑战与前景 | 第14页 |
| 1．7 本试验的设计思路 | 第14-17页 |
| 1．7．1 植物表达载体pBI121-tha的构建 | 第14-15页 |
| 1．7．2 农杆菌对烟草的转化 | 第15-16页 |
| 1．7．3 转基因烟草的检测 | 第16-17页 |
| 1．7．3．1 PCR检测 | 第16页 |
| 1．7．3．2 PCR-Southern检测 | 第16页 |
| 1．7．3．3 Southern检测 | 第16页 |
| 1．7．3．4 RT-PCR检测 | 第16页 |
| 1．7．3．5 SDS-PAGE检测 | 第16页 |
| 1．7．3．6 甜味检测 | 第16-17页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第17-35页 |
| 2 试验材料 | 第17-18页 |
| 2．1 植物材料 | 第17页 |
| 2．2 菌种和质粒 | 第17页 |
| 2．2．1 菌种 | 第17页 |
| 2．2．2 质粒 | 第17页 |
| 2．3 酶和生化试剂 | 第17-18页 |
| 2．4 抗生素和生长激素 | 第18页 |
| 2．5 引物 | 第18页 |
| 3 实验方法 | 第18-35页 |
| 3．1 培养基的配制 | 第18-19页 |
| 3．1．1 原核生物培养基的配制 | 第18页 |
| 3．1．2 植物转化培养基的配制 | 第18-19页 |
| 3．2 thaumatin cDNA基因克隆载体的构建 | 第19-25页 |
| 3．2．1 质粒的提取 | 第19-20页 |
| 3．2．2 质粒的酶切鉴定 | 第20页 |
| 3．2．3 琼脂糖凝胶的制备 | 第20-21页 |
| 3．2．4 重组质粒的连接 | 第21-23页 |
| 3．2．4．1 质粒的双酶切 | 第21-22页 |
| 3．2．4．2 DNA回收 | 第22页 |
| 3．2．4．3 酶切片段的连接 | 第22-23页 |
| 3．2．5 重组质粒的转化 | 第23-24页 |
| 3．2．5．1 大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备 | 第23-24页 |
| 3．2．5．2 克隆载体对大肠杆菌的转化 | 第24页 |
| 3．2．6 重组质粒的筛选 | 第24页 |
| 3．2．7 重组质粒的鉴定 | 第24-25页 |
| 3．3 thaumatin cDNA基因表达载体的构建 | 第25页 |
| 3．3．1 质粒的提取（同上） | 第25页 |
| 3．3．2 质粒的检测（同上） | 第25页 |
| 3．3．3 质粒的重组 | 第25页 |
| 3．3．3．1 质粒的双酶切以及产物的回收 | 第25页 |
| 3．3．3．2 质粒的连接和筛选 | 第25页 |
| 3．4 表达载体对农杆菌的转化 | 第25-26页 |
| 3．4．1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 3．4．2 重组表达载体对农杆菌的转化 | 第26页 |
| 3．4．3 转化质粒的检测 | 第26页 |
| 3．5 转基因烟草植株的获得 | 第26-27页 |
| 3．5．1 烟草无菌苗的准备 | 第26页 |
| 3．5．2 根农杆菌的培养 | 第26页 |
| 3．5．3 叶盘法转化烟草 | 第26-27页 |
| 3．5．4 烟草的移栽 | 第27页 |
| 3．6 转基因烟草的分子检测 | 第27-31页 |
| 3．6．1 烟草再生植株的PCR检测 | 第27页 |
| 3．6．2 转基因植株的PCR-Southern检测 | 第27-28页 |
| 3．6．3 转基因植株的Southern检测 | 第28-31页 |
| 3．6．3．1 转基因烟草总DNA的提取 | 第28页 |
| 3．6．3．2 植物总DNA的限制性酶切 | 第28-29页 |
| 3．6．3．3 Southern印迹 | 第29-30页 |
| 3．6．3．4 预杂交 | 第30页 |
| 3．6．3．5 探针标记—随机引物标记法 | 第30-31页 |
| 3．6．3．6 杂交 | 第31页 |
| 3．6．3．7 洗膜 | 第31页 |
| 3．6．3．8 放射自显影 | 第31页 |
| 3．7 转基因植株的RT-PCR检测 | 第31-32页 |
| 3．7．1 转基因烟草总RNA的提取 | 第31-32页 |
| 3．7．2 RT-PCR检测thaumatin cDNA基因在转基因烟草中的转录 | 第32页 |
| 3．7．2．1 DNA模板第一条链的合成 | 第32页 |
| 3．7．2．2 thaumatin cDNA基因的PCR扩增 | 第32页 |
| 3．8 转基因烟草的SDS-PAGE检测 | 第32-34页 |
| 3．9 转基因烟草的甜味检测 | 第34-35页 |
| 第三部分 结果与讨论 | 第35-47页 |
| 一． 结果 | 第35-45页 |
| 4． 植物表达载体pBI121-tha的构建 | 第35-45页 |
| 4．1 完整thaumatin cDNA基因的获得 | 第35-37页 |
| 4．2 植物表达载体pBI121-tha的获得 | 第37-38页 |
| 4．2．1 pGEM7zf-tha的酶切分析 | 第37页 |
| 4．2．2 pBI121-tha的酶切分析 | 第37-38页 |
| 4．3 叶盘法转化烟草外植体 | 第38-39页 |
| 4．4 转基因烟草的分子检测 | 第39-45页 |
| 4．4．1 转基因烟草的基因组DNA提取结果 | 第39-40页 |
| 4．4．2 基因组DNA的纯度及浓度 | 第40页 |
| 4．4．3 转基因烟草的PCR检测 | 第40-41页 |
| 4．4．4 转基因烟草的PCR-Southern检测 | 第41-42页 |
| 4．4．5 转基因植株的Southern检测 | 第42-43页 |
| 4．4．6 转基因烟草的RT-PCR检测 | 第43-44页 |
| 4．4．6．1 电泳检测提取RNA的完整性 | 第43页 |
| 4．4．6．2 转基因烟草总RNA纯度及浓度检测 | 第43页 |
| 4．4．6．3 转基因烟草RT-PCR检测结果 | 第43-44页 |
| 4．4．7 转基因烟草的SDS-PAGE结果 | 第44-45页 |
| 4．4．8 转基因烟草甜味检测 | 第45页 |
| 二． 讨论 | 第45-47页 |
| 第四部分 结论与展望 | 第47-49页 |
| 第五部分 参考文献 | 第49-52页 |
| 第六部分 附录 | 第52-57页 |
| 附录Ⅰ 化学药品的配制 | 第52-53页 |
| 附录Ⅱ 硕士期间发表或接受的论文 | 第53-54页 |
| 附录Ⅲ 本论文所用到的质粒 | 第54-57页 |
