| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-31页 |
| ·海藻糖 | 第12-18页 |
| ·基本结构 | 第12页 |
| ·理化性质 | 第12-13页 |
| ·海藻糖的生理活性及作用机理 | 第13-14页 |
| ·海藻糖的应用 | 第14-15页 |
| ·海藻糖的生产方法 | 第15-17页 |
| ·酶转化法生产海藻糖 | 第17-18页 |
| ·测定方法 | 第18页 |
| ·MTSase和MTHase | 第18-22页 |
| ·双酶作用机理 | 第19页 |
| ·MTHase研究现况及蛋白质结构 | 第19-21页 |
| ·MTHase酶活测定方法 | 第21-22页 |
| ·毕赤酵母Pichia pastoris表达体系介绍 | 第22-29页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优点 | 第22-23页 |
| ·酵母表达系统常用载体 | 第23-24页 |
| ·外源基因表达方式 | 第24-25页 |
| ·外源蛋白在酵母表达系统中的高效表达策略 | 第25-29页 |
| ·研究背景及思路 | 第29-31页 |
| ·研究背景 | 第29-30页 |
| ·本课题研究目的及思路 | 第30-31页 |
| 第二章 表达载体及菌株的构建 | 第31-44页 |
| ·引言 | 第31-32页 |
| ·实验材料 | 第32-33页 |
| ·菌株和质粒 | 第32页 |
| ·仪器、试剂盒、工具酶、化学试剂 | 第32页 |
| ·PCR引物 | 第32页 |
| ·培养基 | 第32-33页 |
| ·实验方法 | 第33-39页 |
| ·MTHase酶基因(treZ)的扩增 | 第33-34页 |
| ·pPICZαA质粒提取及分步酶切 | 第34-35页 |
| ·E.coli以及P.pastoris感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·对PCR产物进行连接转化 | 第35-36页 |
| ·对连接产物转化E.coli并验证 | 第36页 |
| ·treZ基因片段的获得 | 第36页 |
| ·定向连接 | 第36-37页 |
| ·重组质粒线性化 | 第37页 |
| ·线性化质粒电转P.pastoris | 第37-38页 |
| ·验证 | 第38页 |
| ·毕赤酵母基因组提取方法 | 第38-39页 |
| ·阳性克隆高拷贝转化子的筛选 | 第39页 |
| ·实验结果与讨论 | 第39-43页 |
| ·PCR扩增及产物回收 | 第39-40页 |
| ·阳性克隆筛选验证 | 第40页 |
| ·重组质粒构建 | 第40-42页 |
| ·重组菌P.pastoris GS115以及KM71的构建及验证 | 第42-43页 |
| ·筛选高拷贝转化子 | 第43页 |
| ·本章小结 | 第43-44页 |
| 第三章 MTHase融合蛋白在毕赤酵母中的诱导表达 | 第44-59页 |
| ·引言 | 第44页 |
| ·实验材料 | 第44-45页 |
| ·试剂及培养基 | 第44-45页 |
| ·质粒以及菌株 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-52页 |
| ·甲醇利用表型的检测 | 第45页 |
| ·目的蛋白的诱导分泌表达 | 第45-46页 |
| ·发酵液上清总蛋白检测 | 第46-47页 |
| ·生长曲线的测定 | 第47页 |
| ·发酵液上清蛋白浓缩 | 第47-48页 |
| ·破碎细胞 | 第48页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第48-49页 |
| ·Western-blot检测 | 第49-52页 |
| ·实验结果 | 第52-58页 |
| ·生长曲线的测定 | 第52-53页 |
| ·发酵液中全蛋白含量的测定 | 第53-54页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第54-56页 |
| ·Western-blot检测 | 第56页 |
| ·GS115的RT-PCR验证 | 第56-58页 |
| ·本章小结 | 第58-59页 |
| 第四章 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-63页 |
| 附录 | 第63-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第71-72页 |
| 作者和导师简介 | 第72-73页 |
| 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第73-74页 |
