| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 1 绪论 | 第12-24页 |
| ·羟基脂肪酸概述 | 第12页 |
| ·羟基脂肪酸的主要生产途径 | 第12-13页 |
| ·化学合成途径 | 第12-13页 |
| ·生物合成途径 | 第13页 |
| ·合成羟基脂肪酸的微生物 | 第13-14页 |
| ·脂肪酸羟基化反应的作用机制及基因工程的应用 | 第14-15页 |
| ·微生物的细胞色素P-450 | 第15-16页 |
| ·微生物细胞色素P-450 的分布 | 第15页 |
| ·P-450 的催化机制 | 第15-16页 |
| ·脂肪酸的氧化代谢 | 第16-19页 |
| ·脂肪酸的活化 | 第16页 |
| ·脂酰辅酶A 进入线粒体 | 第16-17页 |
| ·β-氧化反应过程 | 第17-18页 |
| ·脂肪酸β-氧化过程中的基因调控 | 第18-19页 |
| ·脂肪酸的其它氧化形式 | 第19页 |
| ·基因敲除技术 | 第19-22页 |
| ·基因敲除原理 | 第19-20页 |
| ·微生物基因敲除系统 | 第20页 |
| ·原核生物基因敲除策略 | 第20-21页 |
| ·基因敲除技术在菌种改良中的应用 | 第21-22页 |
| ·研究依据、目的和内容 | 第22-24页 |
| 2 脂肪酸Bacillus pumilus 羟基化调控基因fadD 的克隆与序列分析 | 第24-35页 |
| ·材料与方法 | 第24-29页 |
| ·菌株与质粒 | 第24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24-25页 |
| ·主要试剂 | 第25-26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·形态与生理生化鉴定 | 第26页 |
| ·PCR 引物 | 第26页 |
| ·短小芽孢杆菌总DNA 的提取 | 第26-27页 |
| ·PCR 扩增165 rDNA | 第27-28页 |
| ·连接 | 第28页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第28页 |
| ·转化 | 第28页 |
| ·165 rRNA 的测序及同源性比较 | 第28页 |
| ·PCR 扩增fadD 基因 | 第28-29页 |
| ·fadD 基因的序列分析 | 第29页 |
| ·结果与分析 | 第29-34页 |
| ·菌株形态特征 | 第29页 |
| ·菌株生理生化鉴定 | 第29-30页 |
| ·菌株的165 rDNA 序列分析鉴定 | 第30-31页 |
| ·PCR 扩增fadD 基因结果 | 第31页 |
| ·短小芽孢杆菌fadD 基因及其编码氨基酸序列分析 | 第31-32页 |
| ·脂酰辅酶A 合成酶系统进化分析 | 第32-34页 |
| ·本章小结 | 第34-35页 |
| 3 脂酰辅酶A 合成酶基因在大肠杆菌中的表达及酶活测定 | 第35-49页 |
| ·材料与方法 | 第35-44页 |
| ·菌株和质粒 | 第35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35-36页 |
| ·主要试剂 | 第36页 |
| ·培养基 | 第36页 |
| ·PCR 扩增引物 | 第36-37页 |
| ·溶液和缓冲液 | 第37-38页 |
| ·带有特异酶切位点的fadD 基因的克隆 | 第38-39页 |
| ·小量质粒的提取 | 第39-40页 |
| ·酶切 | 第40-41页 |
| ·连接 | 第41页 |
| ·E.Coli BL21 感受态细胞的制备、转化及重组子的筛选 | 第41-42页 |
| ·fadD 基因在E.Coli BL21 中的诱导表达 | 第42页 |
| ·原核表达蛋白样品的准备 | 第42页 |
| ·原核表达蛋白质浓度的测定 | 第42页 |
| ·脂酰辅酶A 合成酶酶活测定 | 第42-44页 |
| ·酶活的计算 | 第44页 |
| ·结果与分析 | 第44-47页 |
| ·PCR 扩增结果 | 第44页 |
| ·重组质粒pET32M-fadD 的构建 | 第44-45页 |
| ·融合基因在E.coli BL21 的表达 | 第45-46页 |
| ·蛋白浓度测定结果 | 第46-47页 |
| ·脂酰辅酶A 合成酶酶活 | 第47页 |
| ·本章小结 | 第47-49页 |
| 4 Bacillus pumilus M-F641 fadD 基因的敲除及简单发酵验证 | 第49-62页 |
| ·材料与方法 | 第49-56页 |
| ·菌株与质粒 | 第49页 |
| ·主要仪器设备 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49-50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·PCR 扩增引物 | 第50页 |
| ·fadD 基因敲除策略 | 第50-53页 |
| ·重组质粒pMD18-T-fadD 的构建 | 第53页 |
| ·重组质粒pMD18-T- fadD::Tetr的构建 | 第53-54页 |
| ·B. pumilus M-F641 原生质体的制备与转化 | 第54-55页 |
| ·转化子的筛选 | 第55页 |
| ·发酵液的萃取 | 第55页 |
| ·样品的甲酯化 | 第55-56页 |
| ·羟基脂肪酸含量测定 | 第56页 |
| ·结果与分析 | 第56-60页 |
| ·重组质粒pMD18-T-fadD 的构建 | 第56-57页 |
| ·四环素抗性基因（Tet~r）的PCR 扩增 | 第57页 |
| ·自杀载体pMD18-T-fadD:: Tetr的构建 | 第57-58页 |
| ·B. pumilus M-F641 菌株fadD 基因的敲除及转化子筛选 | 第58-59页 |
| ·发酵产物的GC 分析 | 第59-60页 |
| ·本章小结 | 第60-62页 |
| 5 结论和建议 | 第62-64页 |
| ·实验结论 | 第62页 |
| ·存在的问题与不足 | 第62-63页 |
| ·进一步研究的建议 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 在学研究成果 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
