| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-38页 |
| 1 导言 | 第13-17页 |
| ·氧化固醇 | 第13页 |
| ·氧化固醇对细胞脂质代谢的影响 | 第13-15页 |
| ·氧化固醇结合蛋白-相关蛋白(ORP)家族的鉴定 | 第15-17页 |
| 2 ORPs的亚细胞分布 | 第17-22页 |
| ·长ORPs的PH结构域和锚重复序列 | 第17-19页 |
| ·ORD的C末端和FFAT基序的作用 | 第19-20页 |
| ·基于定位数据的ORP功能模型 | 第20-22页 |
| 3 哺乳动物ORPs在脂质代谢中的功能 | 第22-30页 |
| ·哺乳动物ORP蛋白的配体 | 第22-23页 |
| ·OSBP在胆固醇和鞘磷脂代谢中的作用 | 第23-25页 |
| ·OSBP和肝脏脂肪生成 | 第25页 |
| ·哺乳动物OSBP同源物参与细胞脂肪代谢 | 第25-29页 |
| ·ORP,LXR和SREBP的假设联系 | 第29-30页 |
| 4 酿酒酵母的ORPs | 第30-34页 |
| ·酵母osh基因在固醇代谢中的作用 | 第30-33页 |
| ·Osh4p调节后高尔基体分泌小泡运输 | 第33-34页 |
| 5 ORP在细胞信号中的功能 | 第34-36页 |
| 6 前景 | 第36-37页 |
| 7 实验方案 | 第37-38页 |
| 第二章 实验材料、主要仪器与试剂或试剂配制 | 第38-50页 |
| 1. 主要仪器 | 第38-39页 |
| 2. 实验材料 | 第39-50页 |
| ·菌种、细胞与质粒 | 第39-41页 |
| ·主要试剂 | 第41-42页 |
| ·主要试剂的配制 | 第42-50页 |
| 第三章 酵母双杂交筛选与ORPs相互作用的蛋白质 | 第50-68页 |
| 1. 前言 | 第50-51页 |
| 2. 实验方法 | 第51-64页 |
| ·诱饵质粒pGBKT7-ORPs的构建 | 第51-54页 |
| ·质粒抽提 | 第54-58页 |
| ·酵母双杂交筛选人胚肾cDNA文库 | 第58-60页 |
| ·酵母双杂交筛选Universal Human cDNA Library | 第60-61页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性检测 | 第61-62页 |
| ·酵母质粒抽提 | 第62-63页 |
| ·酵母质粒电击转化大肠杆菌DH5α | 第63-64页 |
| 3 实验结果 | 第64-68页 |
| ·诱饵质粒pGBKT7-ORPs的构建 | 第64-68页 |
| 第四章 ORPs与候选伴侣蛋白的验证 | 第68-88页 |
| 1. 前言 | 第68页 |
| 2. 实验方法 | 第68-78页 |
| ·GST PULL DOWN | 第68-71页 |
| ·CO-IP实验 | 第71-72页 |
| ·双分子荧光互补实验 | 第72-76页 |
| ·验证ORP8-NUP62的相互作用 | 第76-77页 |
| ·验证ORP9和ORP11的相互作用 | 第77页 |
| ·ORP4与ITPR1之间的相互作用 | 第77-78页 |
| 3. 结果 | 第78-88页 |
| ·GST-Pulldown和CO-IP验证ORP8和NUP62的相互作用 | 第78-79页 |
| ·ORP8和NUP62共定位 | 第79-80页 |
| ·ORP8-NUP62相互作用的关键结果域的鉴定 | 第80-81页 |
| ·ORP9和ORP11相互作用 | 第81-82页 |
| ·ORP9和ORP11相互作用的关键结果域的鉴定 | 第82-85页 |
| ·Co-IP和BiFC确证ORP4-ITPR1相互作用 | 第85页 |
| ·ORP4-ITPR1相互作用的关键结果域的鉴定 | 第85-88页 |
| 第五章 ORP8与NUP62相互作用后通过调节SREBPs的核转运导致脂质稳态在体内外发生改变 | 第88-105页 |
| 1. 前言 | 第88-89页 |
| 2. 材料与方法 | 第89-93页 |
| ·抗体和其他试剂 | 第89-90页 |
| ·cDNA构建 | 第90页 |
| ·腺病毒载体构建 | 第90页 |
| ·C57B/6小鼠静脉注射 | 第90页 |
| ·细胞培养 | 第90-91页 |
| ·RNA干扰 | 第91页 |
| ·定量实时RT-PCR检测 | 第91页 |
| ·核SREBP分析 | 第91-92页 |
| ·胆固醇生物合成分析 | 第92页 |
| ·血浆脂质分析 | 第92-93页 |
| ·肝组织脂肪分析 | 第93页 |
| ·荧光素酶报告基因分析 | 第93页 |
| 3. 结果 | 第93-101页 |
| ·腺病毒介导的ORP8在小鼠肝脏中表达 | 第93-94页 |
| ·腺病毒介导的ORP8会降低肝脏和血浆脂质水平 | 第94-96页 |
| ·ORP8调节SREBP-2靶基因mRNA的表达从而导致胆固醇在Huh7细胞中的生物合成水平下降 | 第96-98页 |
| ·ORP8与NUP62相互作用导致SREBPs核转运水平的降低 | 第98-100页 |
| ·ORP8对SREBP-2产生的影响取决于它的氧化固醇结合域 | 第100-101页 |
| 4. 讨论 | 第101-105页 |
| 第六章 ORP11与ORP9二聚化和其在高尔基体的定位 | 第105-118页 |
| 1. 前言 | 第105-106页 |
| 2. 材料与方法 | 第106-109页 |
| ·抗体和其他试剂 | 第106-107页 |
| ·蛋白质印迹分析 | 第107页 |
| ·cDNA构建 | 第107-108页 |
| ·细胞培养和转染 | 第108页 |
| ·荧光显微镜 | 第108-109页 |
| ·RNA干涉 | 第109页 |
| 3. 结果 | 第109-115页 |
| ·ORP11的特异性的组织和细胞型的表达 | 第109-110页 |
| ·内源性ORP11的细胞定位 | 第110-113页 |
| ·ORP9促进内源性ORP11的高尔基体定位 | 第113-115页 |
| 4. 讨论 | 第115-118页 |
| 第七章 ORP4影响HeLa细胞内Ca~(2-)平衡 | 第118-129页 |
| 1. 前言 | 第118-119页 |
| 2. 实验方法 | 第119-126页 |
| ·[Ca~(2-)]i测定 | 第119-122页 |
| ·RNA抽提 | 第122-123页 |
| ·逆转录 | 第123-125页 |
| ·定量PCR | 第125-126页 |
| 3. 结果 | 第126-129页 |
| ·ORP4敲除抑制组胺诱导的Hela细胞[Ca~(2-)]i的升高 | 第126-127页 |
| ·ORP4敲除促进thapsigargin诱导Hela细胞凋亡 | 第127-129页 |
| 小结 | 第129-130页 |
| 参考文献 | 第130-140页 |
| 附录1 ORP在不同机体中的功能现有的信息总结 | 第140-141页 |
| 附录2 ORP4转录本及组织分布 | 第141-142页 |
| 附录3/4 已投稿文章 | 第142-219页 |
| 在学期间发表论文清单 | 第219-220页 |
| 致谢 | 第220页 |
