| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| Abbreviations | 第16-18页 |
| Chapter1 Introduction | 第18-28页 |
| 1.1 GacS/GacA,two component system | 第18-19页 |
| 1.2 Pseudomonas stutzeri A1501 | 第19-20页 |
| 1.3 Signaling pathway and its role with GacS/GacA two component system in Pseudomonas | 第20-22页 |
| 1.4 Native and synthetic gene regulation to nitrogen limitation stress | 第22-25页 |
| 1.5 Role of sigma factors and its importance in stress | 第25-27页 |
| 1.6 Research plan | 第27-28页 |
| Chapter2 Demonstrating gacS and gacA activity during different abiotic conditions in Pseudomonas stutzeri A1501 | 第28-36页 |
| 2.1 Introduction | 第28页 |
| 2.2 Methods and material | 第28-30页 |
| 2.2.1 Bacterial strains,culture media and growth condition: | 第28-29页 |
| 2.2.2 Analysis at abiotic stress | 第29页 |
| 2.2.3 Nitrogenase activity assays | 第29-30页 |
| 2.2.4 Quantitative real-time qRT-PCR analysis | 第30页 |
| 2.3 Results | 第30-34页 |
| 2.3.1 Effect of high osmolarty | 第30-31页 |
| 2.3.2 Effect of nitrogen starvation on biofilm formation | 第31页 |
| 2.3.3 Effect of low pH | 第31页 |
| 2.3.4 Effect of extreme temperature | 第31-34页 |
| 2.4 Biofilm formation at different oxygen levels | 第34页 |
| 2.5 Nitrogenase activity different oxygen concentrations | 第34-35页 |
| 2.6 Conclusion | 第35-36页 |
| Chapter3 The effect of mutation of anr gene on nitrogen fixation and biofilm formation in Pseudomonas stutzeri A1501 at low levels of oxygen | 第36-62页 |
| 3.1 Introduction | 第36-38页 |
| 3.2 Method and Materials | 第38-39页 |
| 3.2.1 Bacterial strains,culture media,plasmids and growth condition | 第38页 |
| 3.2.2 Growth curve analysis | 第38页 |
| 3.2.3 Oxidative stress analysis: | 第38页 |
| 3.2.4 Estimation of biofilm formation | 第38-39页 |
| 3.2.5 Nitrogenase activity assays | 第39页 |
| 3.2.6 Quantitative Real-Time PCR analysis | 第39页 |
| 3.3 Results | 第39页 |
| 3.4 Construction of anr insertional mutant | 第39-40页 |
| Amplification for anr region of gene for insertion mutation | 第39-40页 |
| 3.5 pJET assembly of gene: | 第40-41页 |
| 3.6 JET plasmid transformed in E.coli: | 第41-42页 |
| 3.7 Formation of pK-18 mob with anr plasmid and transformation in E.coli | 第42-43页 |
| 3.8 Colony PCR | 第43-44页 |
| 3.9 Tri-parental mating or Conjugation: | 第44-46页 |
| 3.9.1 Pre-cultures | 第44页 |
| 3.9.2 Conjugation | 第44-46页 |
| 3.10 Construction of dnr insertional mutant | 第46-48页 |
| 3.10.1 Amplification for dnr region of gene for insertion mutation | 第46页 |
| 3.10.2 Ligating the plasmid pK-18 mob with dnr fragment | 第46-48页 |
| 3.11 Tri-parental mating or conjugation: | 第48-50页 |
| 3.11.1 Pre-cultures | 第48页 |
| 3.11.2 Conjugation | 第48-50页 |
| 3.12 Complimentary Mutant formation: | 第50-52页 |
| 3.12.1 Cutting the Plasmid using restriction enzymes: | 第50页 |
| 3.12.2 Ligating the plasmid pLAFR-3 with anr and dnr gene | 第50页 |
| 3.12.3 Escherichia coli transformation: | 第50-51页 |
| 3.12.4 Colony PCR | 第51页 |
| 3.12.5 Pre-cultures | 第51-52页 |
| 3.12.6 Conjugation | 第52页 |
| 3.13 Bioinformatics Analysis | 第52-55页 |
| 3.13.1 Growth curve analysis | 第53-54页 |
| 3.13.2 Effect of different oxygen concentration on gacS,gacA and anr | 第54-55页 |
| 3.14 Oxidative stress analysis: | 第55-56页 |
| 3.15 Studying biofilm dispersal of anr and dnr genes | 第56-59页 |
| Test tube Biofilm formation | 第56-58页 |
| Relative qRT-PCR analysis for biofilm formation | 第58-59页 |
| 3.16 Nitrogenase activity anr and dnr genes | 第59-60页 |
| 3.17 Relative qRT-PCR analysis for nitrogenase activity | 第60-61页 |
| 3.18 Conclusion | 第61-62页 |
| Chapter4 Functional and regulatory characterization of GacS/GacA two component system in plant associated microorganism Pseudomonas stutzeri A1501 | 第62-99页 |
| 4.1 Introduction | 第62-63页 |
| 4.2 Materials and Method | 第63-65页 |
| 4.2.1 Bacterial strains,culture media,plasmids and growth condition | 第63页 |
| 4.2.2 Strains and plasmids | 第63-64页 |
| 4.2.3 Medium | 第64页 |
| 4.2.4 Enzymes and chemical reagents | 第64-65页 |
| 4.2.5 Major instruments | 第65页 |
| 4.2.6 Commonly used solution and antibiotics | 第65页 |
| 4.3 Experimental methods | 第65-70页 |
| Extraction of bacterial plasmid DNA | 第65-66页 |
| 4.3.1 Isolation of Pseudomonas stutzeri A1501 genome: | 第66-67页 |
| 4.3.2 PCR amplification of genes | 第67-70页 |
| 4.4 Colony PCR | 第70页 |
| 4.5 Extraction of DNA from gel | 第70-71页 |
| 4.6 Tri-parental mating or conjugation | 第71-72页 |
| 4.6.1 Pre-cultures | 第71页 |
| 4.6.2 Conjugation | 第71-72页 |
| 4.7 Selection of the first recombination event | 第72页 |
| 4.8 Selection of the second recombination event | 第72-73页 |
| 4.9 Complimentary mutant formation | 第73-76页 |
| 4.9.0 Amplification of the gene of interest | 第73页 |
| 4.9.1 Cutting the plasmid using restriction enzymes | 第73-74页 |
| 4.9.2 Ligating the plasmid pLAFR-3 with gacS and gacA gene | 第74页 |
| 4.9.3 Escherichia coli transformation | 第74页 |
| 4.9.4 Colony PCR | 第74-75页 |
| 4.9.5 Pre-cultures | 第75页 |
| 4.9.6 Conjugation | 第75-76页 |
| 4.10 Construction of double mutant(ΔgacS/ ΔgacA mutant) | 第76-77页 |
| 4.11 Extraction Of bacterial total RNA | 第77页 |
| 4.12 cDNA reverse transcription synthesis | 第77-78页 |
| 4.13 Growth curve analysis | 第78-79页 |
| 4.13.1 Analysis at abiotic stress using96 well plate for estimation of biofilm formation | 第79页 |
| 4.13.2 Nitrogenase activity assays | 第79页 |
| 4.13.3 Quantitative real-time qRT-PCR analysis | 第79页 |
| 4.14 Fluorescence real-time quantitative PCR | 第79-82页 |
| 4.15 Probe design principles | 第82-83页 |
| 4.16 Results | 第83-84页 |
| 4.16.1 Ligating the up and down regulation gene of gacS with gmR(gentamycin resistant gene) | 第83-84页 |
| 4.16.2 Ligating the plasmid pK18 mob-sacB with up and down regulatory gene of gacS with gmR(gentamycin resistant gene) | 第84页 |
| 4.17 Tri-parental mating or conjugation | 第84-85页 |
| 4.17.1 After first cross | 第84-85页 |
| 4.17.2 After second cross | 第85页 |
| 4.18 Complimentary mutant formation: | 第85-87页 |
| Amplification of the gene of interest | 第86页 |
| Transformation of pLAFR-3 along with gacS gene in E.coli | 第86-87页 |
| 4.19 Construction of double mutant(ΔgacS/ ΔgacA mutant) | 第87页 |
| Relative qRT-PCR analysis for nitrogenase activity | 第87页 |
| 4.20 Bioinformatics Analysis: | 第87-88页 |
| 4.21 Growth curve analysis | 第88-89页 |
| 4.22 Effect of different abiotic stress on biofilm formation | 第89-90页 |
| 4.23 Effect of nitrogen starvation condition | 第90-92页 |
| 4.24 Effect of low pH | 第92页 |
| 4.25 Effect of temperature | 第92-93页 |
| 4.26 Nitrogenase activity | 第93-95页 |
| 4.27 Biofilm formation | 第95-97页 |
| 4.28 Conclusion | 第97-99页 |
| Chapter5 Transcriptome analysis of gacA mutant in Pseudomonas stutzeri A1501 during normal growth curve | 第99-116页 |
| 5.1 Introduction | 第99-100页 |
| 5.2 Method and Materials: | 第100-101页 |
| 5.2.1 Bacterial strains,culture media,plasmids and growth condition | 第100页 |
| 5.2.2 Growth curve analysis | 第100页 |
| 5.2.3 Sample collection | 第100页 |
| 5.2.4 RNA isolation | 第100-101页 |
| 5.2.5 RNA deep seq data analysis | 第101页 |
| 5.3 Results | 第101-115页 |
| 5.3.1 Influence of gacA inactivation on transcriptome profile | 第103页 |
| 5.3.2 gacA targets involved in primary metabolism and energy metabolism | 第103-105页 |
| 5.3.3 Total number of sRNA: | 第105-115页 |
| 5.4 Conclusion: | 第115-116页 |
| Discussion | 第116-123页 |
| Role of sRNA in stress condition | 第118-123页 |
| Reference | 第123-137页 |
| Appendix | 第137-140页 |
| ACKNOWLEDGEMENT | 第140-141页 |
| RESUME | 第141页 |
| Personal Profile | 第141页 |
| Academic Qualification | 第141页 |
| Award and Fellowship | 第141页 |
| Research Publication | 第141页 |
| Thesis titled | 第141页 |
