| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 引言 | 第14-27页 |
| 1.1 旋毛虫及旋毛虫病概述 | 第14-15页 |
| 1.2 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的研究进展 | 第15-23页 |
| 1.2.1 半胱氨酸蛋白酶抑制因子的类型及结构特征 | 第15-16页 |
| 1.2.2 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子 | 第16-18页 |
| 1.2.3 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的作用机制 | 第18-22页 |
| 1.2.4 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子 | 第22-23页 |
| 1.3 旋毛虫的诊断方法 | 第23-25页 |
| 1.4 总结与展望 | 第25-26页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第26-27页 |
| 第二章 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子蛋白功能研究 | 第27-47页 |
| 2.1 材料和方法 | 第27-34页 |
| 2.1.1 虫种、实验动物、质粒、菌株及细胞 | 第27页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.3 旋毛虫各期虫体的收集 | 第28页 |
| 2.1.4 旋毛虫各期虫体总RNA的提取及反转录 | 第28页 |
| 2.1.5 qRT-PCR | 第28-29页 |
| 2.1.6 原核表达载体的构建与鉴定 | 第29-30页 |
| 2.1.7 重组蛋白的诱导表达及纯化 | 第30页 |
| 2.1.8 兔抗TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 重组蛋白高免血清的制备和鉴定 | 第30-31页 |
| 2.1.9 免疫定位 | 第31页 |
| 2.1.10 酶活抑制试验 | 第31-32页 |
| 2.1.11 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的准备 | 第32页 |
| 2.1.12 RAW264.7细胞的培养 | 第32页 |
| 2.1.13 CCK-8检测 | 第32页 |
| 2.1.14 总NO检测 | 第32-33页 |
| 2.1.15 ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子 | 第33页 |
| 2.1.16 重组蛋白免疫保护性试验 | 第33-34页 |
| 2.2 结果与分析 | 第34-44页 |
| 2.2.1 TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2的PCR扩增结果 | 第34页 |
| 2.2.2 旋毛虫TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 的时期表达差异 | 第34-35页 |
| 2.2.3 原核表达重组质粒酶切鉴定结果 | 第35-36页 |
| 2.2.4 重组蛋白的诱导表达及纯化 | 第36-38页 |
| 2.2.5 兔抗TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 重组蛋白高免血清的鉴定 | 第38-39页 |
| 2.2.6 TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 在旋毛虫肌幼虫中的分布 | 第39-40页 |
| 2.2.7 rTsStefin、rTsCystatin1和rTsCystatin2 重组蛋白抑制活性分析 | 第40-41页 |
| 2.2.8 TsCystatins对IFN-γ激活的RAW264.7 细胞的增殖没有影响 | 第41-42页 |
| 2.2.9 TsCystatins抑制IFN-γ激活的RAW264.7 细胞产生NO | 第42页 |
| 2.2.10 TsCystatins对 RAW264.7 细胞产生细胞因子的影响 | 第42-43页 |
| 2.2.11 重组蛋白免疫保护性分析 | 第43-44页 |
| 2.3 讨论 | 第44-47页 |
| 第三章 表达异源半胱氨酸蛋白酶抑制因子弓形虫弱毒株的构建 | 第47-64页 |
| 3.1 材料和方法 | 第47-54页 |
| 3.1.1 实验动物、质粒、虫株及细胞 | 第47页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第47页 |
| 3.1.3 主要溶液的配置 | 第47-48页 |
| 3.1.4 异源表达载体的构建 | 第48-51页 |
| 3.1.5 抗性及异源表达序列的扩增 | 第51页 |
| 3.1.6 CRISPR-Cas9质粒的提取 | 第51页 |
| 3.1.7 转基因弓形虫的构建 | 第51-52页 |
| 3.1.8 转基因弓形虫的PCR鉴定 | 第52页 |
| 3.1.9 转基因弓形虫的间接免疫荧光的鉴定 | 第52页 |
| 3.1.10 转基因弓形虫的Western blot的鉴定 | 第52-53页 |
| 3.1.11 其他弓形虫启动子表达旋毛虫的Stefin及 Cystatin | 第53-54页 |
| 3.2 结果与分析 | 第54-61页 |
| 3.2.1 GRA1启动子和GRA2终止子的扩增 | 第54页 |
| 3.2.2 对Stefin、Cystatin1和Cystatin2 添加3×HA | 第54-55页 |
| 3.2.3 构建异源表达载体序列 | 第55-56页 |
| 3.2.4 构建异源表达载体筛选载体 | 第56-57页 |
| 3.2.5 异源表达及筛选序列的扩增 | 第57页 |
| 3.2.6 无内毒素CRISPR-Cas9质粒的大量提取 | 第57-58页 |
| 3.2.7 转基因弓形虫的单克隆筛选 | 第58页 |
| 3.2.8 转基因弓形虫PCR验证 | 第58-59页 |
| 3.2.9 转基因弓形虫的间接免疫荧光检测 | 第59页 |
| 3.2.10 转基因弓形虫的Western blot检测 | 第59页 |
| 3.2.11 其他弓形虫启动子表达旋毛虫Stefin及 Cystatin | 第59-61页 |
| 3.3 讨论 | 第61-64页 |
| 第四章 RHΔGRA17::TsCystatin2 的生物学特性及免疫保护性研究 | 第64-74页 |
| 4.1 材料和方法 | 第64-66页 |
| 4.1.1 实验动物及虫株 | 第64页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第64页 |
| 4.1.3 主要试剂的配置 | 第64页 |
| 4.1.4 弓形虫裂解抗原的制备 | 第64-65页 |
| 4.1.5 噬斑试验 | 第65页 |
| 4.1.6 入侵试验 | 第65页 |
| 4.1.7 复制试验 | 第65页 |
| 4.1.8 小鼠免疫试验 | 第65-66页 |
| 4.1.9 血清中IgG抗体及IgG1、IgG2a抗体亚类的检测 | 第66页 |
| 4.1.10 脾细胞制备 | 第66页 |
| 4.1.11 细胞因子的检测 | 第66页 |
| 4.2 结果和分析 | 第66-71页 |
| 4.2.1 噬斑试验 | 第66-67页 |
| 4.2.2 入侵试验 | 第67-68页 |
| 4.2.3 胞内增殖试验 | 第68页 |
| 4.2.4 转基因株的免疫原性 | 第68-70页 |
| 4.2.5 转基因株引起的抗旋毛虫免疫反应 | 第70-71页 |
| 4.2.6 旋毛虫减虫率 | 第71页 |
| 4.3 讨论 | 第71-74页 |
| 第五章 旋毛虫重组酶聚合酶扩增检测方法的建立 | 第74-85页 |
| 5.1 材料和方法 | 第74-78页 |
| 5.1.1 试验材料 | 第74页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第74-75页 |
| 5.1.3 组织DNA提取 | 第75页 |
| 5.1.4 引物和探针的设计 | 第75-76页 |
| 5.1.5 RPA琼脂糖凝胶检测方法的建立 | 第76页 |
| 5.1.6 LF-RPA检测方法的建立 | 第76-77页 |
| 5.1.7 传统PCR检测方法的建立 | 第77页 |
| 5.1.8 LF-RPA反应条件的探索 | 第77页 |
| 5.1.9 LF-RPA特异性及灵敏度 | 第77页 |
| 5.1.10 旋毛虫肌幼虫的收集 | 第77页 |
| 5.1.11 LF-RPA检测人工感染样品 | 第77-78页 |
| 5.1.12 肌肉与虫体混合试验 | 第78页 |
| 5.1.13 抑制试验 | 第78页 |
| 5.2 结果与分析 | 第78-82页 |
| 5.2.1 LF-RPA的反应条件 | 第78-79页 |
| 5.2.2 特异性分析 | 第79页 |
| 5.2.3 灵敏度分析 | 第79-81页 |
| 5.2.4 抑制试验 | 第81-82页 |
| 5.2.5 人工感染样品的检测 | 第82页 |
| 5.3 讨论 | 第82-85页 |
| 第六章 全文结论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 作者简介 | 第101页 |
