| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 引言 | 第15-23页 |
| 1 WSSV简介 | 第15-19页 |
| 1.1 WSSV的形态结构 | 第15页 |
| 1.2 WSSV的基因组学和蛋白组学 | 第15-17页 |
| 1.3 WSSV与宿主蛋白之间的互作 | 第17-19页 |
| 1.3.1 网格重链蛋白 | 第17-18页 |
| 1.3.2 RAS蛋白 | 第18页 |
| 1.3.3 Profilin蛋白 | 第18-19页 |
| 2 蛋白与蛋白之间互作的研究技术 | 第19-21页 |
| 2.1 免疫共沉淀技术(Co-immuno precipitation,CoIP) | 第19页 |
| 2.2 表面等离子体共振技术(SPR) | 第19-20页 |
| 2.3 酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第20页 |
| 2.4 酵母双杂交技术 | 第20-21页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第21-23页 |
| 第一章 凡纳滨对虾网格重链蛋白基因克隆、表达及在WSSV侵染过程中的功能研究 | 第23-39页 |
| 1.1 网格重链蛋白基因的克隆与表达 | 第23-33页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第23-24页 |
| 1.1.2 实验方法 | 第24-28页 |
| 1.1.2.1 chc1与chc2基因的克隆 | 第24-25页 |
| 1.1.2.2 表达载体的构建 | 第25-27页 |
| 1.1.2.3 CHC1和CHC2蛋白的表达 | 第27页 |
| 1.1.2.4 Co~(2+)柱亲和层析纯化CHC1和CHC2蛋白 | 第27-28页 |
| 1.1.2.5 CHC1和CHC2蛋白的复性 | 第28页 |
| 1.1.2.6 CHC1和CHC2蛋白的浓缩 | 第28页 |
| 1.1.3 实验结果 | 第28-33页 |
| 1.1.3.1 chc1基因与chc2基因的克隆 | 第28-29页 |
| 1.1.3.2 pBAD/gⅢA-chc1和pBAD/gⅢA-chc2重组质粒的鉴定 | 第29-30页 |
| 1.1.3.3 CHC1和CHC2蛋白的检测 | 第30-32页 |
| 1.1.3.4 蛋白纯化检测 | 第32-33页 |
| 1.2 CHC1和CHC2蛋白与WSSV结构蛋白在体外的相互作用 | 第33-37页 |
| 1.2.1 实验方法 | 第33-35页 |
| 1.2.1.1 DIG标记CHC1和CHC2蛋白 | 第33-34页 |
| 1.2.1.2 Far-western检测CHC1和CHC2蛋白与WSSV结构蛋白的相互作用 | 第34页 |
| 1.2.1.3 ELISA检测WSSV蛋白与CHC1和CHC2蛋白的相互作用. | 第34-35页 |
| 1.2.2 实验结果 | 第35-37页 |
| 1.2.2.1 Far-western检测CHC1和CHC2蛋白与WSSV结构蛋白的互作 | 第35-36页 |
| 1.2.2.2 ELISA分析CHC1、CHC2蛋白与VP26和VP37的互作 | 第36-37页 |
| 1.3 讨论 | 第37-39页 |
| 第二章 凡纳滨对虾Ras基因克隆、表达及在WSSV侵染过程中的功能研究 | 第39-52页 |
| 2.1 Ras基因的克隆与表达 | 第39-45页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第39页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第39-42页 |
| 2.1.2.1 凡纳滨对虾鳃RNA提取 | 第39-40页 |
| 2.1.2.2 凡纳滨对虾鳃cDNA的合成 | 第40-41页 |
| 2.1.2.3 Ras基因的克隆 | 第41页 |
| 2.1.2.4 重组表达载体pBAD/gⅢA-Ras的构建 | 第41页 |
| 2.1.2.5 RAS蛋白的表达 | 第41-42页 |
| 2.1.2.6 Co~(2+)柱亲和层析纯化RAS蛋白 | 第42页 |
| 2.1.2.7 RAS蛋白的复性 | 第42页 |
| 2.1.2.8 RAS蛋白的浓缩 | 第42页 |
| 2.1.3 实验结果 | 第42-45页 |
| 2.1.3.1 Ras基因的克隆 | 第42-43页 |
| 2.1.3.2 重组表达载体pBAD/gⅢA-Ras的鉴定 | 第43页 |
| 2.1.3.3 RAS蛋白的检测 | 第43-45页 |
| 2.1.3.4 RAS蛋白的纯化 | 第45页 |
| 2.2 RAS蛋白与WSSV结构白在体外的相互作用 | 第45-47页 |
| 2.2.1 实验方法 | 第46页 |
| 2.2.1.1 DIG标记RAS蛋白 | 第46页 |
| 2.2.1.2 Far-western检测与RAS蛋白互作的WSSV蛋白 | 第46页 |
| 2.2.1.3 ELISA检测RAS蛋白与VP26的相互作用 | 第46页 |
| 2.2.2 实验结果 | 第46-47页 |
| 2.2.2.1 Far-western检测RAS蛋白与WSSV结构蛋白的相互作用 | 第46-47页 |
| 2.2.2.2 ELISA分析RAS蛋白与VP26的相互作用 | 第47页 |
| 2.3 Ras组织分布及WSSV对Ras表达的影响 | 第47-51页 |
| 2.3.1 实验方法 | 第48-49页 |
| 2.3.1.1 Ras组织分布 | 第48-49页 |
| 2.3.1.2 WSSV对凡纳滨对虾Ras基因表达量的影响 | 第49页 |
| 2.3.2 实验结果 | 第49-51页 |
| 2.3.2.1 Ras基因在各组织中的表达 | 第49-50页 |
| 2.3.2.2 WSSV对Ras表达量的影响 | 第50-51页 |
| 2.4 讨论 | 第51-52页 |
| 第三章 凡纳滨对虾Profilin基因克隆、表达及与WSSV结构蛋白在体外的互作 | 第52-60页 |
| 3.1 Profilin基因的克隆与表达 | 第52-57页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第52页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第52-54页 |
| 3.1.2.1 凡纳滨对虾血细胞中RNA提取 | 第52页 |
| 3.1.2.2 凡纳滨对虾血细胞cDNA合成 | 第52-53页 |
| 3.1.2.3 Profilin基因的克隆 | 第53页 |
| 3.1.2.4 重组表达载体pBAD/gⅢA-Profilin的构建 | 第53页 |
| 3.1.2.5 Profilin蛋白的表达 | 第53页 |
| 3.1.2.6 Co~(2+)柱亲和层析纯化Profilin蛋白 | 第53页 |
| 3.1.2.7 Profilin蛋白的复性 | 第53页 |
| 3.1.2.8 Profilin蛋白的浓缩 | 第53-54页 |
| 3.1.3 实验结果 | 第54-57页 |
| 3.1.3.1 Profilin基因的克隆 | 第54页 |
| 3.1.3.2 重组表达载体pBAD/gⅢA-Profilin的鉴定 | 第54-55页 |
| 3.1.3.3 Profilin蛋白的检测 | 第55-56页 |
| 3.1.3.4 Profilin蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 3.2 Profilin蛋白与3种WSSV结构蛋白在体外的互作 | 第57-58页 |
| 3.2.1 实验方法 | 第57-58页 |
| 3.2.1.1 DIG标记Profilin蛋白 | 第57页 |
| 3.2.1.2 Far-western检测与Profilin蛋白互作的WSSV蛋白 | 第57-58页 |
| 3.2.2 实验结果 | 第58页 |
| 3.2.2.1 Far-western检测与Profilin蛋白互作的WSSV蛋白 | 第58页 |
| 3.3 讨论 | 第58-60页 |
| 第四章 酵母双杂交筛选与wsv079和wsv112互作的宿主蛋白 | 第60-75页 |
| 4.1 凡纳滨对虾肠道cDNA文库构建 | 第60-62页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第60-61页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第61页 |
| 4.1.2.1 Y187感受态制备 | 第61页 |
| 4.1.2.2 凡纳滨对虾肠道cDNA质粒的制备及转化 | 第61页 |
| 4.1.2.3 文库中插入片段长度检测 | 第61页 |
| 4.1.3 实验结果 | 第61-62页 |
| 4.1.3.1 插入文库片段大小的鉴定 | 第61-62页 |
| 4.2 阴性和阳性对照实验 | 第62-64页 |
| 4.2.1 实验方法 | 第62-63页 |
| 4.2.1.1 阴性对照matting与阳性对照matting | 第62-63页 |
| 4.2.2 实验结果 | 第63-64页 |
| 4.3 诱饵载体pGBKT7-079和pGBKT7-112自激性和毒性的检测 | 第64-67页 |
| 4.3.1 实验方法 | 第65页 |
| 4.3.1.1 诱饵载体pGBKT7-079和pGBKT7-112质粒的提取 | 第65页 |
| 4.3.1.2 酵母菌株Y2HGold感受态细胞的制备 | 第65页 |
| 4.3.1.3 诱饵载体pGBKT7-079和pGBKT7-112毒性和自激性的检测 | 第65页 |
| 4.3.2 实验结果 | 第65-67页 |
| 4.3.2.1 诱饵载体毒性和自激性的检测 | 第65-67页 |
| 4.4 酵母双杂交筛选与wsv112相互作用的宿主蛋白 | 第67-73页 |
| 4.4.1 实验方法 | 第67-69页 |
| 4.4.1.1 用pGBKT7-112靶菌株从cDNA文库中筛选互作的蛋白 | 第67-68页 |
| 4.4.1.2 PCR鉴定蓝色克隆中插入cDNA的片段 | 第68页 |
| 4.4.1.3 获得插入片段的质粒 | 第68页 |
| 4.4.1.4 回复杂交 | 第68-69页 |
| 4.4.2 实验结果 | 第69-73页 |
| 4.4.2.1 计算杂交效率 | 第69-70页 |
| 4.4.2.2 酵母双杂交筛选与WSV112互作的蛋白 | 第70-71页 |
| 4.4.2.3 PCR验证蓝色克隆中插入的片段 | 第71-72页 |
| 4.4.2.4 回复杂交验证互作蛋白 | 第72-73页 |
| 4.5 讨论 | 第73-75页 |
| 小结与展望 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-86页 |
| 附录 实验试剂和培养基的制备 | 第86-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
