| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-27页 |
| 1.1 环氧化物水解酶 | 第12-17页 |
| 1.1.1 EHs的来源和分类 | 第13页 |
| 1.1.2 EHs的结构和催化机理 | 第13-15页 |
| 1.1.3 自然界中EHs的“挖掘” | 第15-17页 |
| 1.1.4 EHs基因的异源表达 | 第17页 |
| 1.2 EHs在有机合成中应用 | 第17-20页 |
| 1.2.1 手性环氧化物和邻二醇 | 第17-18页 |
| 1.2.2 EHs催化的环氧化物分类 | 第18-20页 |
| 1.3 EHs-催化反应的工艺优化 | 第20-22页 |
| 1.3.1 固定化 | 第21页 |
| 1.3.2 反应媒介 | 第21-22页 |
| 1.3.3 膜生物反应器 | 第22页 |
| 1.4 EHs的分子改造 | 第22-26页 |
| 1.4.1 定向进化 | 第23页 |
| 1.4.2 高通量筛选方法 | 第23-24页 |
| 1.4.3 基于随机突变的定向进化 | 第24页 |
| 1.4.4 理性设计 | 第24-25页 |
| 1.4.5 基于半理性设计的定向进化 | 第25-26页 |
| 1.5 论文的立题依据及主要研究内容 | 第26-27页 |
| 1.5.1 立题依据和研究意义 | 第26页 |
| 1.5.2 论文的主要研究内容 | 第26-27页 |
| 第二章 宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因克隆及生物信息学分析 | 第27-41页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-29页 |
| 2.2.1 菌种、质粒和培养基 | 第27-28页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第29页 |
| 2.2.4 主要溶剂 | 第29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-33页 |
| 2.3.1 总RNA及基因组DNA的提取 | 第29页 |
| 2.3.2 PCR扩增引物和HSO-T合成 | 第29-30页 |
| 2.3.3 Aueh2基因的克隆 | 第30-33页 |
| 2.3.4 Aueh2基因核苷酸的分析 | 第33页 |
| 2.3.5 Aueh2基因编码蛋白质的分析 | 第33页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第33-40页 |
| 2.4.1 Aueh2基因3′端cDNA的克隆 | 第33-34页 |
| 2.4.2 Aueh2基因侧翼DNA序列的克隆 | 第34页 |
| 2.4.3 Aueh2基因编码区cDNA的克隆 | 第34-35页 |
| 2.4.4 Aueh2基因核苷酸序列分析 | 第35-36页 |
| 2.4.5 AuEH2蛋白质一级结构分析 | 第36页 |
| 2.4.6 AuEH2蛋白质同源序列比对及进化树构建 | 第36-39页 |
| 2.4.7 AuEH2三维结构的同源建模及拓扑结构分析 | 第39-40页 |
| 2.5 本章小结 | 第40-41页 |
| 第三章 AuEH2基因的异源表达及其催化特性研究 | 第41-65页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料 | 第41-43页 |
| 3.2.1 主要材料 | 第41页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第41-43页 |
| 3.2.3 主要溶剂 | 第43页 |
| 3.3 实验方法 | 第43-50页 |
| 3.3.1 Aueh2的异源表达 | 第43页 |
| 3.3.2 环氧化物水解酶活力测定 | 第43-45页 |
| 3.3.3 重组菌E.coli/Aueh2诱导条件优化 | 第45-46页 |
| 3.3.4 重组AuEH2的分离纯化 | 第46页 |
| 3.3.5 重组AuEH2的酶学性质分析 | 第46-47页 |
| 3.3.6 重组菌E.coli/Aueh2水解动力学拆分环氧苯乙烷的催化特性 | 第47-48页 |
| 3.3.7 环氧化物的化学合成及表征 | 第48-49页 |
| 3.3.8 底物谱表征 | 第49页 |
| 3.3.9 分子对接及分子动力学模拟 | 第49-50页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第50-63页 |
| 3.4.1 重组菌E.coli/Aueh2的构建 | 第50-51页 |
| 3.4.2 重组菌E.coli/Aueh2表达产物 | 第51-52页 |
| 3.4.3 重组菌E.coli/Aueh2的诱导条件优化 | 第52-54页 |
| 3.4.4 重组AuEH2的分离纯化 | 第54-55页 |
| 3.4.5 重组AuEH2的酶学性质分析 | 第55-57页 |
| 3.4.6 重组菌E.coli/Aueh2水解动力学拆分环氧苯乙烷的催化特性 | 第57-59页 |
| 3.4.7 底物谱表征 | 第59-62页 |
| 3.4.8 AuEH2对映选择性的分子机理 | 第62-63页 |
| 3.5 本章小结 | 第63-65页 |
| 第四章 有机溶剂/缓冲液双相催化体系的构建及应用 | 第65-81页 |
| 4.1 引言 | 第65页 |
| 4.2 实验材料 | 第65页 |
| 4.2.1 菌种 | 第65页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第65页 |
| 4.3 实验方法 | 第65-68页 |
| 4.3.1 重组AuEH2无细胞抽提液的制备 | 第65-66页 |
| 4.3.2 底物和产物浓度对重组AuEH2酶促反应的影响 | 第66-67页 |
| 4.3.3 有机溶剂的筛选 | 第67页 |
| 4.3.4 有机溶剂/缓冲液双相催化体系构建及筛选 | 第67-68页 |
| 4.3.5 正己醇/缓冲液双相催化体系的工艺优化 | 第68页 |
| 4.3.6 正己醇/缓冲液双相体系中水解动力学拆分高浓度环氧苯乙烷 | 第68页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第68-79页 |
| 4.4.1 单水相体系中的水解动力拆分环氧苯乙烷 | 第68-70页 |
| 4.4.2 底物和产物浓度对酶活力的影响 | 第70页 |
| 4.4.3 有机溶剂的筛选 | 第70-73页 |
| 4.4.4 有机溶剂/缓冲液双相催化体系构建及筛选 | 第73-74页 |
| 4.4.5 正己醇/缓冲液双相催化体系的工艺条件优化 | 第74-78页 |
| 4.4.6 正己醇/缓冲液双相催化体系中高浓度环氧苯乙烷的水解动力学拆分 | 第78-79页 |
| 4.5 本章小结 | 第79-81页 |
| 第五章 基于半理性设计的AuEH2对映选择性的分子改造 | 第81-102页 |
| 5.1 引言 | 第81页 |
| 5.2 实验材料 | 第81页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第81页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第81页 |
| 5.3 实验方法 | 第81-85页 |
| 5.3.1 拟突变氨基酸位点的选择 | 第81-82页 |
| 5.3.2 突变体文库构建 | 第82页 |
| 5.3.3 突变体文库筛选方法 | 第82-83页 |
| 5.3.4 定点饱和突变 | 第83页 |
| 5.3.5 迭代饱和突变 | 第83-84页 |
| 5.3.6 优良突变体的催化特性 | 第84页 |
| 5.3.7 突变酶的分离纯化及动力学常数 | 第84页 |
| 5.3.8 突变体的底物谱解析 | 第84页 |
| 5.3.9 突变体的应用研究 | 第84-85页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第85-101页 |
| 5.4.1 底物结合口袋的分析及拟突变氨基酸位点的选择 | 第85-87页 |
| 5.4.2 突变体文库的构建及筛选 | 第87-90页 |
| 5.4.3 优良突变体的催化特性 | 第90-92页 |
| 5.4.4 优良突变酶的分离纯化及动力学常数测定 | 第92-94页 |
| 5.4.5 突变体的底物谱解析 | 第94-97页 |
| 5.4.6 突变体的应用研究 | 第97-101页 |
| 5.5 本章小结 | 第101-102页 |
| 主要结论与展望 | 第102-104页 |
| 主要结论 | 第102-103页 |
| 展望 | 第103-104页 |
| 论文主要创新点 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-115页 |
| 附录1 | 第115-118页 |
| 附录2:作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第118页 |
