| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-24页 |
| 1.1 应用β-呋喃果糖苷酶合成低聚果糖 | 第11-14页 |
| 1.1.1 低聚果糖FOS | 第11页 |
| 1.1.2 β-呋喃果糖苷酶(3-Ffase)来源和应用 | 第11-13页 |
| 1.1.3 利用毕赤酵母分泌表达β-呋喃果糖苷酶 | 第13-14页 |
| 1.2 毕赤酵母外源蛋白高效表达策略 | 第14-23页 |
| 1.2.1 应用代谢工程提高外源蛋白产量 | 第14-15页 |
| 1.2.1.1 模块途径工程 | 第14页 |
| 1.2.1.2 系统代谢工程和合成代谢工程 | 第14-15页 |
| 1.2.2 启动子工程 | 第15-17页 |
| 1.2.2.1 启动子文库构建 | 第16-17页 |
| 1.2.2.2 应用启动子工程进行代谢工程改造 | 第17页 |
| 1.2.3 基于调控元件的基因表达调控 | 第17-19页 |
| 1.2.3.1 基于终止子改造的基因表达调控 | 第17-18页 |
| 1.2.3.2 基于转录因子的基因表达调控策略 | 第18页 |
| 1.2.3.3 改造核糖体结合位点实现基因的表达调控 | 第18-19页 |
| 1.2.4 改造分泌途径提高外源蛋白产量 | 第19-23页 |
| 1.2.4.1 未折叠蛋白响应(UPR) | 第19-20页 |
| 1.2.4.2 改造内质网降解途径(ERAD) | 第20-21页 |
| 1.2.4.3 蛋白分选和转运途径对外源蛋白分泌影响 | 第21-22页 |
| 1.2.4.4 内吞作用对外源蛋白分泌影响 | 第22-23页 |
| 1.3 课题目的和意义 | 第23-24页 |
| 第二章 材料与方法 | 第24-38页 |
| 2.1 材料 | 第24-29页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第24-26页 |
| 2.1.2 引物序列 | 第26-28页 |
| 2.1.3 工具酶 | 第28页 |
| 2.1.4 抗生素 | 第28页 |
| 2.1.5 培养基 | 第28-29页 |
| 2.1.6 溶液 | 第29页 |
| 2.2 方法 | 第29-38页 |
| 2.2.1 质粒提取 | 第29-30页 |
| 2.2.2 DNA酶切、DNA纯化和连接 | 第30页 |
| 2.2.2.1 DNA酶切 | 第30页 |
| 2.2.2.2 DNA纯化 | 第30页 |
| 2.2.2.3 连接反应 | 第30页 |
| 2.2.3 重组载体转化大肠杆菌感受态细胞: | 第30页 |
| 2.2.4 P.pastoris GS 115感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.2.5 重组质粒电转P.pastoris GS115感受态细胞 | 第30-31页 |
| 2.2.6 重组毕赤酵母的yEGFP测定 | 第31页 |
| 2.2.7 重组蛋白AFT1p~(1-156)分离纯化 | 第31-32页 |
| 2.2.8 凝胶电泳迁移实验(EMSA) | 第32页 |
| 2.2.9 重组毕赤酵母摇瓶发酵产β-Ffase | 第32-33页 |
| 2.2.10 重组毕赤酵母的β-Ffase酶活测定 | 第33-35页 |
| 2.2.10.1 β-Ffase胞外酶活测定 | 第33页 |
| 2.2.10.2 β-Ffase胞内酶活测定 | 第33-34页 |
| 2.2.10.3 葡萄糖标准曲线制备 | 第34-35页 |
| 2.2.10.4 Bradford法绘制蛋白质浓度标准曲线 | 第35页 |
| 2.2.11 重组毕赤酵母干重DCW与OD_(600)的关系曲线 | 第35-36页 |
| 2.2.12 毕赤酵母重组菌的总RNA提取 | 第36页 |
| 2.2.13 看家基因GAP和目的基因的RT-PCR标准曲线 | 第36-38页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第38-67页 |
| 3.1 构建强启动子提高β-呋喃果糖苷酶产量 | 第38-54页 |
| 3.1.1 毕赤酵母组成型强启动子构建与强度表征 | 第38-42页 |
| 3.1.1.1 截短P_(PGK1)构建强启动子 | 第38-40页 |
| 3.1.1.2 P_(PE)、P_(PG)、 P_(PD)截短启动子强度表征 | 第40-42页 |
| 3.1.2 增加转录因子结合位点提高启动子强度 | 第42-45页 |
| 3.1.3 EMSA验证启动子含AFT1p结合位点 | 第45-49页 |
| 3.1.3.1 重组蛋白AFT1p~(1-156)的表达和纯化 | 第46-48页 |
| 3.1.3.2 重组蛋白AFT1p~(1-156)与启动子体外结合实验 | 第48-49页 |
| 3.1.4 利用强启动子调控β-呋喃果糖苷酶基因表达 | 第49-54页 |
| 3.1.4.1 β-Ffase分泌表达的毕赤酵母重组菌构建 | 第50-52页 |
| 3.1.4.2 重组菌β-Ffase酶活检测 | 第52-54页 |
| 小结 | 第54页 |
| 3.2 过表达转录因子AFT1促进重组菌β-呋喃果糖苷酶的分泌 | 第54-59页 |
| 3.2.1 过表达转录因子AFT1重组菌构建 | 第55-56页 |
| 3.2.2 过表达转录因子AFT1对β-呋喃果糖苷酶分泌的影响 | 第56-59页 |
| 小结 | 第59页 |
| 3.3 过表达分泌途径相关基因提高β-呋喃果糖苷酶分泌 | 第59-67页 |
| 3.3.1 重组菌分泌途径相关基因转录水平检测 | 第59-60页 |
| 3.3.2 过表达分泌途径相关基因重组菌的构建 | 第60-63页 |
| 3.3.3 分泌途径相关基因对β-呋喃果糖苷酶分泌影响 | 第63-65页 |
| 小结 | 第65-67页 |
| 第四章 总结与展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文和发明专利情况 | 第84页 |
