酯酶EstB表达纯化及酶学性质分析
| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-10页 |
| 引言 | 第10-16页 |
| 1. 脂肪酶 | 第10-13页 |
| ·脂肪酶简介 | 第10页 |
| ·脂肪酶的结构特征与酶学特性 | 第10-11页 |
| ·极端环境下的脂肪酶 | 第11页 |
| ·碱性脂肪酶 | 第11-12页 |
| ·酯酶与脂肪酶的关系 | 第12页 |
| ·脂肪酶的应用及展望 | 第12-13页 |
| 2. 利用宏基因组学技术筛选新型脂肪酶 | 第13-16页 |
| ·宏基因组技术起源 | 第13页 |
| ·宏基因组研究现状概述 | 第13页 |
| ·基于宏基因组学的脂肪酶筛选 | 第13-14页 |
| ·宏基因组应用前景 | 第14-16页 |
| 第一章 实验材料 | 第16-20页 |
| ·阳性克隆的来源 | 第16页 |
| ·菌株与质粒 | 第16页 |
| ·主要试剂 | 第16-17页 |
| ·抗生素 | 第16页 |
| ·试剂 | 第16-17页 |
| ·试剂盒 | 第17页 |
| ·工具酶与Marker | 第17页 |
| ·主要仪器 | 第17-18页 |
| ·培养基 | 第18页 |
| ·常用溶液 | 第18-20页 |
| 第二章 实验流程及方法 | 第20-29页 |
| ·实验流程 | 第20页 |
| ·实验方法 | 第20-23页 |
| ·阳性克隆的获得 | 第20页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定 | 第20-21页 |
| ·克隆酯酶estB 基因 | 第21-22页 |
| ·酯酶基因目的片段的生物信息学分析 | 第22页 |
| ·克隆载体pET28a 的线性化 | 第22页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第22-23页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第23页 |
| ·高效表达菌株的构建 | 第23页 |
| ·重组表达蛋白菌株诱导条件的摸索 | 第23页 |
| ·分子生物学常规实验方法 | 第23-26页 |
| ·碱变性法提取质粒DNA | 第23-24页 |
| ·大肠杆菌CaCl_2感受态细胞的制备 | 第24页 |
| ·大肠杆菌CaCl_2感受态细胞的转化方法 | 第24页 |
| ·重组菌株蛋白的诱导表达步骤 | 第24-25页 |
| ·镍柱纯化可溶性蛋白步骤 | 第25页 |
| ·聚集体蛋白的变性及纯化 | 第25页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳配制 | 第25-26页 |
| ·蛋白电泳样品处理及电泳 | 第26页 |
| ·酶学性质初步表征 | 第26-29页 |
| ·考马斯亮蓝法测定蛋白浓度 | 第26-27页 |
| ·酯酶活力的测定 | 第27页 |
| ·酶底物特异性的测定 | 第27页 |
| ·最适温度的测定 | 第27页 |
| ·温度对酶活力稳定性的影响 | 第27页 |
| ·最适pH 的测定 | 第27-28页 |
| ·金属离子和去污剂的影响 | 第28-29页 |
| 第三章 实验结果 | 第29-43页 |
| ·阳性克隆酶切验证结果 | 第29页 |
| ·克隆酯酶 estB 基因 PCR 结果 | 第29-30页 |
| ·插入片段的生物信息学分析结果 | 第30-35页 |
| ·estB 基因编码的酯酶水解酶理化性质分析 | 第30-31页 |
| ·二级结构预测 | 第31页 |
| ·亲水性疏水性分析 | 第31-32页 |
| ·信号肽和结构域预测 | 第32-34页 |
| ·三维结构可能性预测（271-390） | 第34页 |
| ·同源性分析 | 第34-35页 |
| ·表达载体的鉴定结果 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白表达纯化电泳图谱 | 第36-39页 |
| ·信号肽对诱导前后表达量的影响 | 第36-37页 |
| ·对不含信号肽表达菌株的上清液进行纯化图谱 | 第37-38页 |
| ·对不含有信号肽的表达菌株沉淀进行破碎后纯化图谱 | 第38页 |
| ·沉淀中纯化蛋白考马斯亮蓝染色与活性染色对比图谱 | 第38-39页 |
| ·酶学性质初步表征结果 | 第39-43页 |
| ·底物特异性 | 第39-40页 |
| ·酶最适温度的测定 | 第40页 |
| ·温度对酶活力稳定性的影响 | 第40-41页 |
| ·pH 对酶活力的影响 | 第41页 |
| ·不同离子和去污剂对酶活力的影响 | 第41-43页 |
| 结论 | 第43-44页 |
| 讨论 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-48页 |
| 致谢 | 第48页 |
