| 摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-20页 |
| 1.1 奶牛乳腺组织的发育 | 第13-14页 |
| 1.2 miRNAs的研究现状 | 第14-17页 |
| 1.2.1 miRNAs的发现以及命名 | 第14-15页 |
| 1.2.2 miRNAs生物学特征 | 第15页 |
| 1.2.3 miRNAs的生成过程 | 第15页 |
| 1.2.4 miRNAs的功能 | 第15-16页 |
| 1.2.5 miRNAs的检测技术 | 第16-17页 |
| 1.3 miRNA与奶牛乳腺发育的研究现状 | 第17-18页 |
| 1.4 miR-486的研究概况 | 第18页 |
| 1.5 Pten基因的研究 | 第18-19页 |
| 1.6 研究的目的与意义 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-40页 |
| 2.1 验证bta-miR-486在奶牛乳腺组织与芯片结果差异 | 第20-23页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第20页 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 | 第20页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第20页 |
| 2.1.4 RNA提取 | 第20-21页 |
| 2.1.5 RNA质量检测 | 第21页 |
| 2.1.6 实时荧光定量PCR | 第21-23页 |
| 2.2 miR-486在奶牛乳腺组织中的表达 | 第23-24页 |
| 2.2.1 主要试剂和耗材 | 第23页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第23页 |
| 2.2.3 原位杂交具体步骤 | 第23-24页 |
| 2.3 靶向奶牛Pten基因的bta-miR-486荧光素酶载体构建 | 第24-28页 |
| 2.3.1 主要试剂和耗材 | 第24页 |
| 2.3.2 主要仪器 | 第24页 |
| 2.3.3 靶基因的预测 | 第24-25页 |
| 2.3.4 奶牛乳腺组织总RNA的反转录 | 第25页 |
| 2.3.5 目的片段的扩增与纯化 | 第25-26页 |
| 2.3.6 含目的片段的T载体质粒构建与测序 | 第26-28页 |
| 2.3.7 含目的片段的荧光素酶报告基因重组质粒载体的构建与测序 | 第28页 |
| 2.4 靶基因验证 | 第28-30页 |
| 2.4.1 主要试剂和耗材 | 第28-29页 |
| 2.4.2 主要仪器 | 第29页 |
| 2.4.3 HEK-293细胞的传代培养 | 第29-30页 |
| 2.4.4 双荧光素酶活性的检测 | 第30页 |
| 2.5 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定 | 第30-32页 |
| 2.5.1 主要试剂和耗材 | 第30页 |
| 2.5.2 主要仪器 | 第30-31页 |
| 2.5.3 奶牛乳腺上皮细胞的培养 | 第31页 |
| 2.5.4 乳腺上皮细胞鉴定 | 第31-32页 |
| 2.6 bta-miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞的影响 | 第32-37页 |
| 2.6.1 主要试剂和耗材 | 第32页 |
| 2.6.2 主要仪器 | 第32页 |
| 2.6.3 miR-486 mimics转染奶牛乳腺上皮细胞 | 第32页 |
| 2.6.4 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞miR-486基因、Pten及其下游信号通路基因表达的影响 | 第32-33页 |
| 2.6.5 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞Pten蛋白表达的影响 | 第33页 |
| 2.6.6 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响 | 第33-35页 |
| 2.6.7 miR-486mimics对乳腺上皮细胞的影响 | 第35-37页 |
| 2.6.8 免疫组化 | 第37页 |
| 2.7 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞的影响 | 第37-38页 |
| 2.7.1 主要试剂和耗材 | 第37页 |
| 2.7.2 主要仪器 | 第37页 |
| 2.7.3 miR-486 inhibitor转染奶牛乳腺上皮细胞 | 第37-38页 |
| 2.7.4 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞miR-486基因、Pten及其下游信号通路基因表达的影响 | 第38页 |
| 2.7.5 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞Pten蛋白表达的影响 | 第38页 |
| 2.7.6 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响 | 第38页 |
| 2.7.7 miR-486 inhibitor对乳腺上皮细胞的影响 | 第38页 |
| 2.7.8 免疫组化 | 第38页 |
| 2.8 数据统计处理与统计分析 | 第38-40页 |
| 3 结果 | 第40-62页 |
| 3.1 奶牛乳腺组织RNA提取质量检验结果 | 第40页 |
| 3.2 miR-486在奶牛乳腺组织中的表达 | 第40-42页 |
| 3.3 验证bta-miR-486在奶牛乳腺组织与芯片结果差异 | 第42页 |
| 3.4 奶牛乳腺上皮细胞的培养及鉴定 | 第42-43页 |
| 3.5 靶向奶牛Pten基因的miR-486荧光素酶载体构建 | 第43-45页 |
| 3.5.1 miR-486靶基因预测结果 | 第43-44页 |
| 3.5.2 报告基因载体的构建与鉴定 | 第44页 |
| 3.5.3 荧光素酶活性检测 | 第44-45页 |
| 3.6 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞的影响 | 第45-53页 |
| 3.6.1 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞中Pten蛋白位置的影响 | 第45-46页 |
| 3.6.2 miR-486超表达对奶牛上皮细胞活性的影响 | 第46-47页 |
| 3.6.3 miR-486超表达对奶牛上皮细胞DNA增殖率的影响 | 第47-48页 |
| 3.6.4 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞周期的影响 | 第48页 |
| 3.6.5 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞miR-486、Pten及下游信号通路基因的表达 | 第48-49页 |
| 3.6.6 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞Pten及下游信号通路基因蛋白表达的影响 | 第49-50页 |
| 3.6.7 miR-486超表达对奶牛上皮细胞泌乳功能影响的结果 | 第50-53页 |
| 3.7 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞的影响 | 第53-62页 |
| 3.7.1 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞中Pten蛋白位置的影响 | 第53-54页 |
| 3.7.2 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞活性的影响 | 第54页 |
| 3.7.3 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞细胞DNA增殖率的影响 | 第54-55页 |
| 3.7.4 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞周期的影响 | 第55-56页 |
| 3.7.5 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞miR-486、Pten及下游信号通路基因的表达 | 第56-57页 |
| 3.7.6 miR-486基因沉寂对奶牛乳腺上皮细胞Pten及下游信号通路基因蛋白表达的影响 | 第57-58页 |
| 3.7.7 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞泌乳功能影响的结果 | 第58-62页 |
| 4 讨论 | 第62-66页 |
| 4.1 靶基因的预测及鉴定 | 第62-63页 |
| 4.2 miR-486在奶牛乳腺组织的表达 | 第63-64页 |
| 4.3 miR-486对乳腺上皮细胞泌乳信号转导途径的影响 | 第64-65页 |
| 4.4 miR-486对奶牛乳腺细胞增殖和泌乳的作用及其机制 | 第65-66页 |
| 5 结论 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-73页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第73页 |
