| TABLE OF CONTENTS | 第5-9页 |
| LIST OF FIGURES | 第9-11页 |
| LIST OF TABLES | 第11-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| CHAPTER 1. INTRODUCTION | 第14-33页 |
| 1.1. Phytate and phytases | 第15-19页 |
| 1.1.1. Phytate | 第15-17页 |
| 1.1.2. Phytase | 第17-19页 |
| 1.2. Sources of Phytase | 第19-24页 |
| 1.2.1. Microbes | 第19-21页 |
| 1.2.1.1. Fungal source | 第19-20页 |
| 1.2.1.2. Bacterial source | 第20-21页 |
| 1.2.1.3. Yeast source | 第21页 |
| 1.2.2. Plant source | 第21-22页 |
| 1.2.3. Animal sources | 第22-24页 |
| 1.3. Recombinant phytase expression | 第24-25页 |
| 1.4. Structure | 第25-30页 |
| 1.4.1. Histidine acid phosphatases (HAPs) | 第25-27页 |
| 1.4.2. β-propeller phytases (βPP) | 第27页 |
| 1.4.3. Cysteine phosphatase (CPs) | 第27-28页 |
| 1.4.4. Purple acid phosphatases (PAPs) | 第28-30页 |
| 1.5. Application of phytase | 第30-32页 |
| 1.5.1. Production of phytase in transgenic plants | 第30页 |
| 1.5.2. Feed application | 第30-31页 |
| 1.5.3. Food application | 第31-32页 |
| 1.5.4. Pulp and paper industry | 第32页 |
| 1.6. Scope of the thesis | 第32-33页 |
| CHAPTER 2. SCREENING, CLONING AND SEQUENCING OF PHYTASE FROM ASPERGILLUS FUMIGATUS | 第33-47页 |
| 2.1 Materials | 第33-34页 |
| 2.1.1 Stains and vectors | 第33页 |
| 2.1.2 Apparatus | 第33页 |
| 2.1.3 Reagents | 第33-34页 |
| 2.2 Methods | 第34-38页 |
| 2.2.1 Microorganism and growth media | 第34页 |
| 2.2.2 RNA isolation from Aspergillus fumigatus | 第34-35页 |
| 2.2.3 cDNA synthesis by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) | 第35页 |
| 2.2.4 Amplification of phytase gene | 第35-36页 |
| 2.2.5 Construction of cloning vector pMD18T-phyA | 第36页 |
| 2.2.6 Preparation of competent cells | 第36-37页 |
| 2.2.7 Transformation | 第37页 |
| 2.2.8 Preparation of plasmids | 第37-38页 |
| 2.2.9 Identification of positive recombinant clones | 第38页 |
| 2.2.10 DNA sequence and computer analysis | 第38页 |
| 2.3 Result and discussion | 第38-47页 |
| 2.3.1 Screening for phytase-producing from A. fumigatus | 第38-39页 |
| 2.3.2 Total RNA Isolation and Reverse Transcription | 第39-40页 |
| 2.3.3 PCR amplification of phytase gene from A. fumigatus | 第40-41页 |
| 2.3.4 Construction of cloning plasmid pMD18T-PhyA | 第41-42页 |
| 2.3.5 Sequence Analysis | 第42-47页 |
| CHAPTER 3. EXPRESSION AND OPTIMIZATION OF PHYTASE GENE (PhyA) IN ESCHERICHIA COLI | 第47-54页 |
| 3.1 Material | 第47页 |
| 3.1.1 Bacterial strain and plasmid | 第47页 |
| 3.1.2 Reagents | 第47页 |
| 3.2 Methods | 第47-50页 |
| 3.2.1 Construction of expression vector pET21-phy A | 第47-48页 |
| 3.2.2 Transformation of competent Escherichia coli | 第48页 |
| 3.2.3 Expression of pET21-phyA gene in E. coli | 第48页 |
| 3.2.4 Phytase activity assay | 第48-49页 |
| 3.2.5 Total protein assay | 第49-50页 |
| 3.2.6 Optimization of phytase expression | 第50页 |
| 3.3 Results and discussion | 第50-54页 |
| 3.3.1 Construction of prokaryotic expression vector pET21-phy A | 第50-51页 |
| 3.3.2 Effect of incubation temperature | 第51页 |
| 3.3.3 Effect of IPTG concentration | 第51-52页 |
| 3.3.4 Effects of Ca2+ ion concentration | 第52-54页 |
| CHAPTER 4. CHARACTERIZATION OF PHYTASE (PhyA) AS INCLUSION BODIES IN E.COLI | 第54-61页 |
| 4.1 Materials | 第54页 |
| 4.1.1 Bacterial strains | 第54页 |
| 4.1.2 Reagents | 第54页 |
| 4.2 Methods | 第54-56页 |
| 4.2.1 Expression of recombinant phytase | 第54页 |
| 4.2.2 Isolation of inclusion bodies | 第54-55页 |
| 4.2.3 Solubilization and refolding of PhyA proteins | 第55页 |
| 4.2.4 Dialysis | 第55-56页 |
| 4.2.5 Concentration with Poly Ethylene Glycol (PEG) 20,000 | 第56页 |
| 4.2.6 Effects of temperature and pH on phytase activity and stability | 第56页 |
| 4.2.6.1 Optimum temperature | 第56页 |
| 4.2.6.2 Optimum pH | 第56页 |
| 4.3 Result and Discussion | 第56-61页 |
| 4.3.1 Expression of recombinant pET21a-PhyA in E.coli | 第56-58页 |
| 4.3.2 Effects of temperature and pH on phytase activity | 第58-61页 |
| 4.3.2.1 Optimum temperature and thermostability | 第58-59页 |
| 4.3.2.2 Optimum pH and pH stability | 第59-61页 |
| CHAPTER 5. CONCLUSION | 第61-63页 |
| REFERENCES | 第63-70页 |
| APPENDICES | 第70-78页 |
| APPENDIX Ⅰ. Czapek-Dox agar medium for screening phytase | 第70页 |
| APPENDIX Ⅱ. cDNA synthesis by reverse transcriptase polymerase chain reaction | 第70-71页 |
| APPENDIX Ⅲ. Reaction mix for PhyA amplification | 第71页 |
| APPENDIX Ⅳ. Agarose gel electrophoresis | 第71-72页 |
| APPENDIX Ⅴ. Ligation recipes | 第72-73页 |
| APPENDIX Ⅵ. Ligation of PhyA insert and pET21a | 第73页 |
| APPENDIX Ⅶ. Reagents for plasmid isolation | 第73-74页 |
| APPENDIX Ⅷ. Sodium Dodecyl Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE) | 第74-76页 |
| APPENDIX Ⅸ. Determination of Phytase Activity-Molybdate-Blue Method(Fujian Fuda Biotech Co., Ltd.) | 第76-78页 |
| ACKNOWLEDGEMENTS | 第78页 |
