| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 缩写说明 | 第17-19页 |
| 第一章 前言 | 第19-42页 |
| 1 微生物来源天然产物研究现状 | 第19-20页 |
| 2 微生物来源天然产物发掘方法 | 第20-39页 |
| 2.1 挖掘特殊生境微生物资源 | 第20-26页 |
| 2.1.1 海洋微生物 | 第21-22页 |
| 2.1.2 植物内生菌 | 第22页 |
| 2.1.3 未培养微生物 | 第22-23页 |
| 2.1.4 被忽视的微生物 | 第23-26页 |
| 2.2 改进微生物培养方法 | 第26-29页 |
| 2.2.1 营养条件调控 | 第26-27页 |
| 2.2.2 微生物共培养 | 第27-28页 |
| 2.2.3 N-乙酰氨基葡萄糖系统 | 第28页 |
| 2.2.4 诱导小分子 | 第28-29页 |
| 2.3 基因组挖掘 | 第29-33页 |
| 2.3.1 过表达正调控因子 | 第31-32页 |
| 2.3.2 敲除负调控因子 | 第32页 |
| 2.3.3 置换启动子 | 第32-33页 |
| 2.4 异源表达 | 第33-35页 |
| 2.4.1 宏基因组 | 第33-34页 |
| 2.4.2 沉默基因簇 | 第34-35页 |
| 2.5 工程技术 | 第35-38页 |
| 2.5.1 代谢工程 | 第35页 |
| 2.5.2 核糖体工程 | 第35-37页 |
| 2.5.3 组合生物合成 | 第37-38页 |
| 2.6 合成生物学 | 第38-39页 |
| 3 安莎霉素类抗生素简介 | 第39-40页 |
| 4 本学位论文研究背景,内容及意义 | 第40-42页 |
| 第二章 材料与方法 | 第42-74页 |
| 1 实验材料 | 第42-53页 |
| 1.1 菌株 | 第42-45页 |
| 1.2 质粒 | 第45-47页 |
| 1.3 培养基 | 第47-48页 |
| 1.4 化学试剂 | 第48-52页 |
| 1.5 主要仪器 | 第52-53页 |
| 2 实验方法 | 第53-74页 |
| 2.1 菌株培养及保藏 | 第53页 |
| 2.2 大肠杆菌质粒DNA提取 | 第53-54页 |
| 2.3 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第54页 |
| 2.4 PCR扩增基因片段 | 第54-55页 |
| 2.5 PCR产物纯化 | 第55页 |
| 2.6 DNA片段回收 | 第55-56页 |
| 2.7 质粒和DNA片段酶切 | 第56页 |
| 2.8 质粒酶切产物去磷酸化 | 第56页 |
| 2.9 目的片段与载体连接 | 第56-57页 |
| 2.10 质粒DNA转化大肠杆菌 | 第57页 |
| 2.11 蛋白异源表达与纯化 | 第57-59页 |
| 2.12 蛋白晶体获得 | 第59-60页 |
| 2.13 基因定点突变 | 第60页 |
| 2.14 基因转录分析 | 第60-63页 |
| 2.15 静息细胞培养 | 第63页 |
| 2.16 生物活性测定 | 第63-64页 |
| 2.17 链霉菌基因组DNA提取 | 第64-66页 |
| 2.18 基因组fosmid文库构建 | 第66-68页 |
| 2.19 文库的筛选 | 第68-70页 |
| 2.20 目的基因敲除 | 第70-71页 |
| 2.21 接合转移 | 第71-72页 |
| 2.22 菌株发酵检测 | 第72-73页 |
| 2.23 生物信息学分析 | 第73-74页 |
| 第三章 结果与分析 | 第74-162页 |
| 第一节 Streptomyces sp.LZ35中安莎生物合成基因簇分析 | 第74-84页 |
| 1.1 LZ35菌株全基因组测序 | 第74-76页 |
| 1.2 LZ35菌株中安莎基因簇的定位及序列分析 | 第76-82页 |
| 1.2.1 Hygrocin生物合成基因簇序列分析 | 第76-78页 |
| 1.2.2 Geldanamycin生物合成基因簇序列分析 | 第78-80页 |
| 1.2.3 沉默新安莎生物合成基因簇序列分析 | 第80-82页 |
| 1.3 小结与讨论 | 第82-84页 |
| 第二节 Streptomyces sp.LZ35菌株中沉默新安莎基因簇特征分析 | 第84-97页 |
| 2.1 沉默新安莎基因簇生物信息学分析 | 第84-95页 |
| 2.1.1 起始单元AHBA生物合成基因 | 第84-85页 |
| 2.1.2 聚酮合酶基因 | 第85-91页 |
| 2.1.3 奈环形成基因 | 第91-92页 |
| 2.1.4 延伸单元合成基因 | 第92-93页 |
| 2.1.5 酰胺合酶基因 | 第93-94页 |
| 2.1.6 基因簇中调控因子 | 第94-95页 |
| 2.2 沉默新安莎基因簇代谢产物结构预测 | 第95-96页 |
| 2.3 小结与讨论 | 第96-97页 |
| 第三节 Streptomyces sp.LZ35菌株的遗传改造 | 第97-106页 |
| 3.1 LZ35菌株遗传操作体系的建立 | 第97-100页 |
| 3.1.1 生长培养基选择 | 第97-98页 |
| 3.1.2 抗生素敏感实验 | 第98页 |
| 3.1.3 接合转移条件优化 | 第98-99页 |
| 3.1.4 基因阻断流程建立 | 第99-100页 |
| 3.2 LZ35菌株中部分次级代谢生物合成基因簇阻断 | 第100-105页 |
| 3.2.1 LZ35ΔgdmAI突变株构建 | 第100-101页 |
| 3.2.2 LZ35ΔgdmAIΔnigA突变株构建 | 第101-102页 |
| 3.2.3 LZ35ΔgdmAIΔnigA△elpA突变株构建 | 第102-103页 |
| 3.2.4 LZ35△gdmAIΔnigA△elpAΔhgcA突变株构建 | 第103-105页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第105-106页 |
| 第四节 Streptomyces sp.LZ35菌株中沉默新安莎基因簇的激活 | 第106-120页 |
| 4.1 大规模发酵未能获得沉默新安莎基因簇的代谢产物 | 第106页 |
| 4.2 红霉素抗性基因启动子ermEp~*置换PKS基因启动子 | 第106-110页 |
| 4.2.1 启动子置换突变株构建 | 第107页 |
| 4.2.2 启动子置换突变株代谢产物分析 | 第107-109页 |
| 4.2.3 启动子置换突变株转录分析 | 第109-110页 |
| 4.3 敲除nam基因簇中途径专一性负调控基因 | 第110-112页 |
| 4.3.1 TetR敲除突变株的构建 | 第110-111页 |
| 4.3.2 TetR敲除突变株代谢产物分析 | 第111-112页 |
| 4.4 过表达nam基因簇中途径专一性正调控基因 | 第112-116页 |
| 4.4.1 过表达Nam1基因的突变株构建与分析 | 第112-114页 |
| 4.4.2 沉默安莎基因簇的验证 | 第114-115页 |
| 4.4.3 未知安莎化合物产量提高 | 第115页 |
| 4.4.4 过表达Nam1突变株转录分析 | 第115-116页 |
| 4.5 沉默安莎基因簇代谢产物分离及结构鉴定 | 第116-117页 |
| 4.6 Neoansamycin的生物活性 | 第117-118页 |
| 4.7 小结与讨论 | 第118-120页 |
| 第五节 Neoansamycin的生物合成研究 | 第120-129页 |
| 5.1 敲除ccr基因突变株的构建及分析 | 第120-122页 |
| 5.2 Nam8蛋白表达及纯化 | 第122-123页 |
| 5.3 Nam8蛋白结晶 | 第123-124页 |
| 5.4 Neoansamycin基因簇中其他基因功能验证 | 第124-126页 |
| 5.4.1 基因阻断突变株构建 | 第124-125页 |
| 5.4.2 突变株代谢产物HPLC分析 | 第125-126页 |
| 5.5 Neoansamycin生物合成途径推测 | 第126-127页 |
| 5.6 小结与讨论 | 第127-129页 |
| 第六节 Hygrocin的生物合成研究 | 第129-162页 |
| 6.1 Hygrocin生物合成基因簇的确证 | 第130-132页 |
| 6.1.1 Hygrocin聚酮合酶基因分析 | 第130-131页 |
| 6.1.2 敲除hgcA基因突变株的构建与分析 | 第131-132页 |
| 6.2 Hygrocin中AHBA起始单元合成 | 第132-135页 |
| 6.2.1 LZ35菌株中AHBA生物合成基因分析 | 第132-133页 |
| 6.2.2 敲除AHBA合酶基因突变株的构建与分析 | 第133-135页 |
| 6.3 Hygrocin的释放与环化 | 第135-141页 |
| 6.3.1 酰胺合酶基因分析 | 第135-136页 |
| 6.3.2 敲除hgcF基因突变株的构建 | 第136-137页 |
| 6.3.3 酰胺合酶基因回补菌株的构建 | 第137-139页 |
| 6.3.4 酰胺合酶基因回补菌株代谢产物HPLC分析 | 第139-140页 |
| 6.3.5 回补菌株SR307ALT代谢产物分离鉴定 | 第140-141页 |
| 6.4 Hygrocin中乙基丙二酰辅酶A单元的合成 | 第141-143页 |
| 6.5 Hygrocin生物合成调控 | 第143-145页 |
| 6.5.1 调控基因突变株构建与分析 | 第143-144页 |
| 6.5.2 Hgc1正调控hygrocin的生物合成 | 第144-145页 |
| 6.6 Hygrocin氧化后修饰基因 | 第145-148页 |
| 6.7 Hgc2参与hygrocin奈环形成 | 第148-151页 |
| 6.7.1 基因hgc2对突变株SR315回补 | 第148-149页 |
| 6.7.2 基因rif-orfl9对突变株SR315回补 | 第149-151页 |
| 6.8 Hgc3参与hygrocin C5/C6位氧插入 | 第151-153页 |
| 6.8.1 基因hgc3对突变株SR316回补 | 第151-152页 |
| 6.8.2 突变株SR316代谢产物DM12的分离 | 第152-153页 |
| 6.9 Hgc4参与hygrocin C7位羟基化 | 第153-156页 |
| 6.9.1 基因hgc4对突变株SR317回补 | 第153-154页 |
| 6.9.2 突变株SR317代谢产物的分离 | 第154-155页 |
| 6.9.3 Hgc4蛋白表达及纯化 | 第155页 |
| 6.9.4 Hgc4体外催化活性 | 第155-156页 |
| 6.10 Hygrocin结构理性改造 | 第156-159页 |
| 6.10.1 HgcE中DH基因敲除突变株构建 | 第157页 |
| 6.10.2 HgcE中DH基因点突变 | 第157-159页 |
| 6.10.3 点突变菌株SR321代谢产物HPLC分析 | 第159页 |
| 6.11 Hyrocin生物合成途径推测 | 第159-160页 |
| 6.12 小结与讨论 | 第160-162页 |
| 第四章 总结与展望 | 第162-165页 |
| 1 本研究工作总结 | 第162-163页 |
| 2 本研究工作展望 | 第163-165页 |
| 参考文献 | 第165-176页 |
| 附录 | 第176-191页 |
| 致谢 | 第191-193页 |
| 博士期间发表的学术论文 | 第193页 |
