| 摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 引言 | 第12-33页 |
| 1.1 转基因植物研究进展及转基因产品安全性问题 | 第12-14页 |
| 1.2 世界各国对转基因产品含量的规定 | 第14-15页 |
| 1.3 植物转基因方法与外源目的基因拷贝数的关系 | 第15-19页 |
| 1.3.1 农杆菌介导法 | 第15-16页 |
| 1.3.2 基因枪法 | 第16-17页 |
| 1.3.3 电激穿孔法 | 第17页 |
| 1.3.4 脂质体法 | 第17页 |
| 1.3.5 花粉管通道法 | 第17-18页 |
| 1.3.6 化学物质诱导法 | 第18页 |
| 1.3.7 微注射法 | 第18-19页 |
| 1.4 转基因植物检测技术与检测阈值 | 第19-24页 |
| 1.4.1 DNA水平上的检测方法 | 第20-22页 |
| 1.4.1.1 定性PCR检测 | 第20页 |
| 1.4.1.2 定量PCR检测 | 第20-21页 |
| 1.4.1.3 Southern Blotting | 第21-22页 |
| 1.4.1.4 基因芯片 | 第22页 |
| 1.4.2 蛋白质水平上的检测方法 | 第22-23页 |
| 1.4.2.1 酶联免疫吸附法 | 第22-23页 |
| 1.4.2.2 免疫试纸条法 | 第23页 |
| 1.4.2.3 Western Blotting | 第23页 |
| 1.4.3 植物转基因检测新技术 | 第23-24页 |
| 1.5 影响转基因植物PCR检测技术准确性的因素 | 第24-26页 |
| 1.5.1 DNA质量 | 第24-25页 |
| 1.5.2 转基因植物外源目的基因拷贝数 | 第25页 |
| 1.5.3 PCR反应程序 | 第25页 |
| 1.5.4 退火温度 | 第25-26页 |
| 1.5.5 Taq酶质量 | 第26页 |
| 1.5.6 转基因阳性对照的作用及局限性 | 第26页 |
| 1.6 甘蔗染色体的复杂性及转基因检测存在的问题 | 第26-27页 |
| 1.7 外源基因拷贝数检测方法 | 第27页 |
| 1.8 研究内源低拷贝基因的意义 | 第27-31页 |
| 1.8.1 转基因植物PCR检测内参基因研究进展 | 第27-29页 |
| 1.8.2 内源低拷贝基因的特征和PCR检测技术要求 | 第29页 |
| 1.8.3 内源低拷贝基因的应用 | 第29-31页 |
| 1.8.3.1 物种特异性鉴定 | 第29-30页 |
| 1.8.3.2 DNA提取和纯化的质量 | 第30页 |
| 1.8.3.3 判断PCR检测结果的精确性 | 第30页 |
| 1.8.3.4 建立定量检测标准曲线 | 第30-31页 |
| 1.9 本研究的目的和技术路线 | 第31-33页 |
| 1.9.1 本研究的目的和意义 | 第31页 |
| 1.9.2 本研究的技术路线 | 第31-33页 |
| 2 材料与方法 | 第33-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第33-34页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第33页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第33-34页 |
| 2.1.3 主要试剂和耗材 | 第34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-44页 |
| 2.2.1 甘蔗材料的遗传背景和代表性分析 | 第34-35页 |
| 2.2.2 总DNA提取与质量测定 | 第35页 |
| 2.2.3 已有转基因植物内参基因同源检测筛选 | 第35-38页 |
| 2.2.3.1 引物设计 | 第35页 |
| 2.2.3.2 PCR反应体系和程序 | 第35页 |
| 2.2.3.3 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析 | 第35-36页 |
| 2.2.3.4 目的片段回收 | 第36-37页 |
| 2.2.3.5 目的片段的克隆和测序 | 第37-38页 |
| 2.2.4 已知低拷贝基因同源检测筛选 | 第38-39页 |
| 2.2.4.1 引物设计 | 第38页 |
| 2.2.4.2 PCR反应体系和程序 | 第38页 |
| 2.2.4.3 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析 | 第38页 |
| 2.2.4.4 目的片段回收 | 第38页 |
| 2.2.4.5 目的片段的克隆和测序 | 第38-39页 |
| 2.2.5 根据基因功能检测筛选 | 第39页 |
| 2.2.5.1 引物设计 | 第39页 |
| 2.2.5.2 PCR反应体系和程序 | 第39页 |
| 2.2.5.3 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析 | 第39页 |
| 2.2.5.4 目的片段回收 | 第39页 |
| 2.2.5.5 目的片段的克隆和测序 | 第39页 |
| 2.2.6 入选基因片段实时荧光定量PCR拷贝数分析 | 第39-40页 |
| 2.2.7 低拷贝基因Southern Blotting鉴定 | 第40-44页 |
| 2.2.7.1 探针制备 | 第40页 |
| 2.2.7.2 探针标记效果测定 | 第40-41页 |
| 2.2.7.3 基因组DNA的制备 | 第41页 |
| 2.2.7.4 DNA(gDNA)酶切产物回收纯化 | 第41-42页 |
| 2.2.7.5 凝胶处理 | 第42页 |
| 2.2.7.6 制桥与转膜 | 第42-43页 |
| 2.2.7.7 膜固定与预杂交 | 第43页 |
| 2.2.7.8 洗膜 | 第43页 |
| 2.2.7.9 免疫测定 | 第43-44页 |
| 2.2.8 甘蔗内源低拷贝基因的定性与定量检测体系 | 第44页 |
| 2.2.9 入选低拷贝基因实证应用 | 第44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-103页 |
| 3.1 甘蔗材料的遗传背景和代表性分析 | 第44-45页 |
| 3.2 DNA质量检测 | 第45-46页 |
| 3.3 已有转基因植物内参基因同源检测筛选 | 第46-52页 |
| 3.3.1 引物序列与PCR反应参数 | 第47-48页 |
| 3.3.2 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析 | 第48-51页 |
| 3.3.3 目的片段回收测序 | 第51-52页 |
| 3.4 已知低拷贝基因同源检测筛选 | 第52-58页 |
| 3.4.1 引物序列与PCR反应参数 | 第52-54页 |
| 3.4.2 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析 | 第54-58页 |
| 3.4.3 目的片段回收测序 | 第58页 |
| 3.5 根据基因功能检测筛选 | 第58-73页 |
| 3.5.1 引物序列与PCR反应参数 | 第58-61页 |
| 3.5.2 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析 | 第61-71页 |
| 3.5.3 目的片段回收测序 | 第71-73页 |
| 3.6 候选基因特异片段的筛选 | 第73-89页 |
| 3.7 实时荧光定量PCR | 第89-98页 |
| 3.7.1 实时荧光定量PCR反应体系和反应程序 | 第89-90页 |
| 3.7.2 实时荧光定量PCR引物扩增效率 | 第90-93页 |
| 3.7.3 实时荧光定量PCR溶解曲线分析 | 第93-96页 |
| 3.7.4 甘蔗内源基因拷贝数 | 第96-98页 |
| 3.8 Southern Blotting分析 | 第98-101页 |
| 3.8.1 ALS基因的探针制备 | 第98页 |
| 3.8.2 探针标记灵敏度 | 第98-99页 |
| 3.8.3 甘蔗基因组DNA酶切效果与Southern Blotting结果 | 第99-101页 |
| 3.9 甘蔗内源低拷贝基因的定性与定量检测体系 | 第101-103页 |
| 3.9.1 甘蔗内源低拷贝基因定性检测体系 | 第101-102页 |
| 3.9.2 甘蔗内源低拷贝基因定量检测体系 | 第102-103页 |
| 3.10 甘蔗内源低拷贝基因PCR检测体系的应用 | 第103页 |
| 4 讨论 | 第103-106页 |
| 4.1 实验材料的选择 | 第103-104页 |
| 4.2 定性PCR与实时荧光定量PCR的退火温度不同的分析 | 第104-105页 |
| 4.3 ALS基因在甘蔗和玉米上的分析 | 第105页 |
| 4.4 实时荧光定量PCR拷贝数计算公式分析 | 第105页 |
| 4.5 ALS基因的Southern blotting分析 | 第105-106页 |
| 5 结论 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-111页 |
| 附录 | 第111-115页 |
| 附录Ⅰ 缩写词(Abbreviation) | 第111-112页 |
| 附录Ⅱ CTAB法 | 第112-113页 |
| 附录Ⅲ Southern Blotting试剂 | 第113-115页 |
| 致谢 | 第115页 |
