| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 符号说明 | 第14-15页 |
| 第一部分 糖基工程酵母表达重组人凝血酶原2的研究 | 第15-45页 |
| 第一章 前言 | 第15-18页 |
| 1.1 糖基工程酵母表达凝血酶原2的概述 | 第15-16页 |
| 1.2 毕赤酵母和293T细胞表达重组Ecarin蛋白酶的概述 | 第16-17页 |
| 1.3 重组人凝血酶原2的纯化及活化后功能研究 | 第17-18页 |
| 第二章 实验材料 | 第18-22页 |
| 2.1 质粒 | 第18页 |
| 2.2 菌株和细胞株 | 第18页 |
| 2.3 工具酶、抗体及主要试剂 | 第18-19页 |
| 2.4 主要培养基 | 第19页 |
| 2.5 主要溶液 | 第19-20页 |
| 2.6 仪器 | 第20-22页 |
| 第三章 实验方法 | 第22-28页 |
| 3.1 Prethrombin-2在毕赤酵母中的表达和纯化 | 第22-23页 |
| 3.1.1 Prethrombin-2的全基因合成及分泌表达载体的构建 | 第22页 |
| 3.1.2 Prethrombin-2在糖基工程酵母菌株中的重组筛选 | 第22页 |
| 3.1.3 Prethrombin-2在糖基工程酵母中的表达和纯化 | 第22-23页 |
| 3.2 Ecarin的全基因合成及多种分泌表达载体的构建 | 第23-25页 |
| 3.2.1 Ecarin全基因合成的pPICZαA/Ecarin-His分泌型表达载体的构建 | 第23页 |
| 3.2.2 pPICZαA/Ecarin-Fac-His分泌型表达载体的构建 | 第23-24页 |
| 3.2.3 pPICZαA/Ecarin-RSR和pPICZαA/Ecarin-RKK分泌型表达载体的构建 | 第24页 |
| 3.2.4 pPICZαA/Ecarin-Incell胞内表达载体的构建 | 第24-25页 |
| 3.2.5 pcDNA3.1/Ecarin分泌型表达载体的构建 | 第25页 |
| 3.3 Ecarin分泌型表达载体在野生型酵母X33中的表达 | 第25页 |
| 3.4 Ecarin胞内表达载体在野生酵母X33中的表达 | 第25-26页 |
| 3.5 Ecarin分泌型表达载体在293T细胞中的表达 | 第26页 |
| 3.6 S-2238比色法测凝血酶活性 | 第26页 |
| 3.7 凝血时间的测定 | 第26-28页 |
| 第四章 实验结果 | 第28-43页 |
| 4.1 Prethrombin-2的全基因合成及表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 4.2 Prethrombin-2在糖基工程酵母中的表达和纯化 | 第29-30页 |
| 4.3 Ecarin的全基因合成及多种分泌表达载体的构建 | 第30-34页 |
| 4.3.1 Ecarin全基因合成及分泌型表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 4.3.2 pPICZαA/Ecarin-Fac-His分泌型表达载体的构建 | 第31-32页 |
| 4.3.3 pPICZαA/Ecarin-RSR和pPICZαA/Ecarin-RKK分泌型表达载体的构建 | 第32-33页 |
| 4.3.4 pPICZαA/Ecarin-Incell胞内表达载体的构建 | 第33页 |
| 4.3.5 pcDNA3.1/Ecarin分泌型表达载体的构建 | 第33-34页 |
| 4.4 Ecarin分泌型表达载体在野生酵母X33中的分泌表达 | 第34-38页 |
| 4.4.1 Ecarin-His在野生酵母X33中的分泌表达 | 第34-35页 |
| 4.4.2 Ecarin-Fac-His在野生型酵母X33中的分泌表达 | 第35页 |
| 4.4.3 氨基酸突变的Ecarin-RSR和Ecarin-RKK在野生型酵母X33中的分泌表达 | 第35-37页 |
| 4.4.4 X33/pPICZαA/Ecarin-RSR培养上清的镍柱亲和层析 | 第37-38页 |
| 4.4.5 Ecarin-Incell在野生型酵母X33的胞内表达 | 第38页 |
| 4.5 pcDNA3.1/Ecarin分泌型表达载体在293T细胞中表达 | 第38-40页 |
| 4.6 Ecarin活化的凝血酶原2的活性分析 | 第40-41页 |
| 4.7 凝血时间的测定 | 第41-43页 |
| 第五章 小结与讨论 | 第43-45页 |
| 5.1 小结 | 第43页 |
| 5.2 讨论 | 第43-45页 |
| 第二部分 糖基工程酵母表达重组人丁酰胆碱酯酶的研究 | 第45-70页 |
| 第一章 前言 | 第45-48页 |
| 1.1 丁酰胆碱酯酶的研究进展 | 第45页 |
| 1.2 毕赤酵母表达重组全长人丁酰胆碱酯酶的概述 | 第45-46页 |
| 1.3 毕赤酵母表达重组截短型人丁酰胆碱酯酶的概述 | 第46页 |
| 1.4 毕赤酵母表达融合HSA的截短型BChe的概述 | 第46-47页 |
| 1.5 毕赤酵母共表达全长BChe和多聚脯氨酸的概述 | 第47页 |
| 1.6 重组BChe蛋白的纯化和分析 | 第47-48页 |
| 第二章 实验材料 | 第48-51页 |
| 2.1 质粒 | 第48页 |
| 2.2 菌株 | 第48页 |
| 2.3 工具酶、抗体及主要试剂 | 第48-49页 |
| 2.4 主要培养基 | 第49页 |
| 2.5 主要溶液 | 第49-50页 |
| 2.6 仪器 | 第50-51页 |
| 第三章 实验方法 | 第51-56页 |
| 3.1 丁酰胆碱酯酶的基因合成及多种分泌表达载体的构建 | 第51-53页 |
| 3.1.1 丁酰胆碱酯酶的全基因合成及pPICZαA/BChe表达载体的构建 | 第51页 |
| 3.1.2 引物设计 | 第51-52页 |
| 3.1.3 pPICZαA/BCheC表达载体的构建 | 第52页 |
| 3.1.4 pPICZαB/HSA表达载体的构建 | 第52页 |
| 3.1.5 pPICZαB/BCheB-HSA表达载体的构建 | 第52-53页 |
| 3.1.6 pPICZαA/BChe/polyp-HSA表达载体的构建 | 第53页 |
| 3.2 重组BChe在毕赤酵母中的转化和表达 | 第53-54页 |
| 3.3 Ellman法 | 第54页 |
| 3.4 重组BCheB-HSA蛋白的纯化和分析 | 第54-56页 |
| 第四章 实验结果 | 第56-68页 |
| 4.1 丁酰胆碱酯酶的全基因合成及pPICZαA/BChe分泌型表达载体的构建 | 第56-60页 |
| 4.1.1 丁酰胆碱酯酶全基因合成 | 第56-57页 |
| 4.1.2 pPICZαA/BCheC表达载体的构建 | 第57-58页 |
| 4.1.3 pPICZαB/HSA表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 4.1.4 pPICZaB/BCheB-HSA表达载体的构建 | 第59页 |
| 4.1.5 pPICZαA/BChe/polyp-HSA表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 4.2 重组丁酰胆碱酯酶在野生酵母中的表达和酶活分析 | 第60-64页 |
| 4.2.1 BChe在野生型酵母X33中的表达 | 第60-61页 |
| 4.2.2 截短型BCheC在野生型酵母X33中的表达 | 第61-62页 |
| 4.2.3 融合型BCheB-HSA在野生型酵母X33中的表达 | 第62-63页 |
| 4.2.4 BChe和polyp-HSA在野生型酵母X33中共表达 | 第63-64页 |
| 4.3 糖基工程酵母表达重组丁酰胆碱酯酶的纯化和分析 | 第64-68页 |
| 4.3.1 融合型BCheB-HSA和共表达BChe/polyp-HAS在糖基工程酵母中的表达 | 第64-66页 |
| 4.3.2 BCheB-HSA5的表达、纯化及活性分析 | 第66-68页 |
| 第五章 小结与讨论 | 第68-70页 |
| 5.1 小结 | 第68页 |
| 5.2 讨论 | 第68-70页 |
| 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
| 硕士期间发表论文 | 第77页 |
