| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 引言 | 第16-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-53页 |
| 综述一 牛病毒性腹泻病毒的分子生物学特征 | 第18-29页 |
| 1 BVDV概况 | 第18-21页 |
| 1.1 BVD流行病学 | 第18-19页 |
| 1.2 BVDV生物多样性 | 第19-21页 |
| 2 BVDV基因组特性 | 第21-25页 |
| 2.1 非编码区域 | 第21-22页 |
| 2.2 结构蛋白 | 第22-23页 |
| 2.3 非结构蛋白 | 第23-25页 |
| 3 BVDV的持续性感染 | 第25-28页 |
| 3.1 持续性感染的特征 | 第25-26页 |
| 3.2 持续性感染的发生机制 | 第26-27页 |
| 3.3 BVDV持续性感染的研究进展 | 第27-28页 |
| 4 小结与展望 | 第28-29页 |
| 综述二 细胞自噬与病原体感染 | 第29-44页 |
| 1 自噬概况 | 第29-32页 |
| 1.1 自噬的起源 | 第29页 |
| 1.2 自噬的定义 | 第29-30页 |
| 1.3 自噬的类型 | 第30-31页 |
| 1.4 自噬相关蛋白 | 第31-32页 |
| 2 自噬体发生的分子机制 | 第32-33页 |
| 3 自噬的检测技术和研究方法 | 第33-39页 |
| 3.1 自噬的检测技术 | 第33-38页 |
| 3.2 自噬抑制剂和促进剂 | 第38-39页 |
| 3.2.1 自噬抑制剂 | 第38-39页 |
| 3.2.2 自噬促进剂 | 第39页 |
| 4 自噬影响病原体感染 | 第39-40页 |
| 4.1 自噬促进宿主细胞对病原体的清除 | 第39-40页 |
| 4.2 自噬促进胞内病原体的增殖 | 第40页 |
| 5 自噬与黄病毒科病毒感染 | 第40-43页 |
| 5.1 自噬与黄病毒属病毒 | 第41-42页 |
| 5.2 自噬与瘟病毒属病毒 | 第42页 |
| 5.3 自噬与肝炎病毒属病毒 | 第42-43页 |
| 6 小结与展望 | 第43-44页 |
| 综述三microRNA调控病毒复制 | 第44-53页 |
| 1 miRNA概述 | 第44-50页 |
| 1.1 miRNA的发现 | 第44页 |
| 1.2 miRNA的生物起源 | 第44-46页 |
| 1.3 miRNA作用机制 | 第46页 |
| 1.4 miRNA主要研究方法 | 第46-50页 |
| 2 miRNA与病毒 | 第50-52页 |
| 2.1 宿主miRNA在病毒感染过程中的调节作用 | 第50-52页 |
| 2.2 病毒编码miRNA调控病毒的复制 | 第52页 |
| 3 小结与展望 | 第52-53页 |
| 第二部分 实验研究 | 第53-165页 |
| 实验一 BVDV NADL影响细胞自噬水平的研究 | 第53-79页 |
| 1 材料与方法 | 第54-64页 |
| 1.1 材料 | 第54-55页 |
| 1.2 方法 | 第55-64页 |
| 2 结果 | 第64-76页 |
| 2.1 正常和病毒感染的MDBK细胞形态观察 | 第64页 |
| 2.2 GFP-LC3转染MDBK细胞情况 | 第64-65页 |
| 2.3 透射电镜观察自噬体和自噬溶酶体结构 | 第65页 |
| 2.4 荧光倒置显微镜观察GFP-LC3 puncta阳性细胞 | 第65-66页 |
| 2.5 激光共聚焦显微镜观察自噬溶酶体的形成 | 第66-67页 |
| 2.6 自噬相关蛋白Beclin1和ATG14 mRNA转录水平检测 | 第67-68页 |
| 2.7 自噬相关蛋白Beclin1和ATG14蛋白表达水平检测 | 第68页 |
| 2.8 红色荧光蛋白标记的慢病毒过表达载体pLEX-Td-tomato的构建 | 第68-69页 |
| 2.9 过表达BVDV NADL糖蛋白慢病毒载体的构建 | 第69-70页 |
| 2.10 BVDV NADL糖蛋白过表达的慢病毒构建并感染MDBK细胞 | 第70页 |
| 2.11 实时定量PCR检测BVDV NADL糖蛋白的表达情况 | 第70-71页 |
| 2.12 Western blot检测慢病毒感染后BVDV NADL糖蛋白表达水平 | 第71-72页 |
| 2.13 电镜观察慢病毒感染对MDBK细胞自噬的影响 | 第72页 |
| 2.14 激光共聚焦观察慢病毒感染MDBK细胞中GFP-LC3 puncta分布情况 | 第72-73页 |
| 2.15 统计慢病毒感染后GFP-LC3 puncta阳性细胞率 | 第73-74页 |
| 2.16 Western blot检测慢病毒感染后自噬底物p62/SQSTM1的表达水平 | 第74页 |
| 2.17 实时定量PCR检测慢病毒感染后ATG14和Beclin1的转录水平 | 第74-75页 |
| 2.18 Western blot检测自噬相关蛋白ATG14和Beclin1的蛋白水平 | 第75-76页 |
| 3 讨论 | 第76-78页 |
| 3.1 自噬检测手段 | 第76-77页 |
| 3.2 黄病毒科病毒的结构蛋白 | 第77页 |
| 3.3 病毒与自噬相互作用 | 第77-78页 |
| 4 小结 | 第78-79页 |
| 实验二 细胞自噬改变对BVDV NADL复制的影响研究 | 第79-96页 |
| 1 材料与方法 | 第80-86页 |
| 1.1 材料 | 第80-81页 |
| 1.2 方法 | 第81-86页 |
| 2 结果 | 第86-93页 |
| 2.1 自噬抑制剂 3-MA和渥曼青霉素处理能显著性抑制细胞自噬的水平 | 第86-87页 |
| 2.2 自噬抑制剂 3-MA和渥曼青霉素处理显著性抑制BVDV NADL的复制 | 第87-88页 |
| 2.3 自噬诱导剂rapamycin处理后能显著性增加细胞自噬的水平 | 第88-89页 |
| 2.4 早期细胞自噬有助于BVDV NADL胞内复制 | 第89-90页 |
| 2.5 Beclin 1 和LC3 干扰效率的检测 | 第90-91页 |
| 2.6 Beclin 1 和LC3 干扰后显著性抑制细胞自噬的水平 | 第91-92页 |
| 2.7 Beclin 1 和LC3 干扰后显著性抑制BVDV NADL的复制 | 第92-93页 |
| 3 讨论 | 第93-95页 |
| 3.1 自噬对BVDV复制的影响 | 第93-94页 |
| 3.2 自噬抑制剂的作用 | 第94页 |
| 3.3 自噬促进剂的作用 | 第94-95页 |
| 3.4 自噬相关蛋白的抑制 | 第95页 |
| 4 小结 | 第95-96页 |
| 实验三 mi R-29b影响BVDV感染诱导的细胞自噬及BVDV复制的分子机制研究 | 第96-124页 |
| 1 材料与方法 | 第97-108页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第97-98页 |
| 1.2 方法 | 第98-108页 |
| 2 结果 | 第108-122页 |
| 2.1 表达红色荧光蛋白的慢病毒载体p LL3.7-td-Tomato构建 | 第108-109页 |
| 2.2 pre-mi R-29b表达的慢病毒载体构建 | 第109页 |
| 2.3 慢病毒pre-mi R-29b-lv和Antagomir-29b处理后mi R-29b的转录水平检测 | 第109-110页 |
| 2.4 BVDV NADL感染后mi R-29b的转录水平检测 | 第110-111页 |
| 2.5 自噬通路中mi R-29b靶蛋白预测 | 第111页 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第111页 |
| 2.7 双荧光素酶报告基因分析鉴定mi R-29b靶蛋白 | 第111-112页 |
| 2.8 实时定量PCR鉴定mi R-29b靶基因的转录水平 | 第112-113页 |
| 2.9 Western blot鉴定mi R-29b靶蛋白的表达水平 | 第113-114页 |
| 2.10 激光共聚焦显微镜观察细胞自噬 | 第114-115页 |
| 2.11 Western blot检测自噬底物p62/SQSTM1 蛋白水平 | 第115页 |
| 2.12 实时定量PCR检测BVDV NADL E1 转录水平 | 第115-116页 |
| 2.13 感染后不同时间点BVDV NADL滴度测定 | 第116页 |
| 2.14 ATG14 和ATG9A慢病毒表达载体构建 | 第116-117页 |
| 2.15 实时定量PCR检测ATG14 和ATG9A的转录水平 | 第117-118页 |
| 2.16 Western blot检测ATG14 和ATG9A的表达水平 | 第118-119页 |
| 2.17 激光共聚焦显微镜检测GFP-LC3 puncta分布和统计分析自噬细胞率 | 第119-120页 |
| 2.18 ATG14 和ATG9A过表达对自噬底物p62 表达的影响 | 第120页 |
| 2.19 ATG14 和ATG9A过表达对BVDV NADL复制水平的影响检测 | 第120-122页 |
| 3 讨论 | 第122-123页 |
| 3.1 mi RNA与病原体复制 | 第122页 |
| 3.2 mi R-29 家族的功能 | 第122-123页 |
| 4 小结 | 第123-124页 |
| 实验四 mi R-29b影响细胞凋亡的分子机制研究 | 第124-139页 |
| 1 材料与方法 | 第125-131页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第125页 |
| 1.2 方法 | 第125-131页 |
| 2 结果 | 第131-137页 |
| 2.1 mi R-29b mimics显著性抑制MDBK细胞凋亡 | 第131页 |
| 2.2 mi R-29b靶向凋亡相关基因caspase-7 和NAIF1 | 第131-132页 |
| 2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第132页 |
| 2.4 双荧光素酶报告系统分析 | 第132-133页 |
| 2.5 实时定量PCR检测caspase-7 和NAIF1 转录水平 | 第133-134页 |
| 2.6 Western blot检测caspase-7 和NAIF1 蛋白水平 | 第134页 |
| 2.7 Caspase-7 和NAIF1 慢病毒表达载体的构建 | 第134-135页 |
| 2.8 实时定量PCR检测慢病毒感染后caspase-7 和NAIF1 转录水平 | 第135页 |
| 2.9 Western blot检测慢病毒感染后caspase-7 和NAIF1 蛋白水平 | 第135-136页 |
| 2.10 慢病毒感染后MDBK细胞凋亡水平检测 | 第136-137页 |
| 3 讨论 | 第137-138页 |
| 3.1 细胞凋亡与病原体 | 第137-138页 |
| 3.2 病毒调控细胞凋亡的机制 | 第138页 |
| 4 小结 | 第138-139页 |
| 实验五 BVDV NADL定点突变株的构建 | 第139-165页 |
| 1 材料与方法 | 第140-151页 |
| 1.1 材料 | 第140-141页 |
| 1.2 方法 | 第141-151页 |
| 2 结果 | 第151-162页 |
| 2.1 成功构建T7RNAP基因原核表达载体 | 第151-152页 |
| 2.2 原核表达T7RNAP蛋白鉴定 | 第152页 |
| 2.3 成功构建T7RNAP基因慢病毒表达载体 | 第152-153页 |
| 2.4 慢病毒包装 | 第153页 |
| 2.5 嘌呤霉素筛选T7RNAP稳定表达的MDBK细胞 | 第153-154页 |
| 2.6 荧光实时定量PCR检测T7RNAP m RNA水平 | 第154页 |
| 2.7 p ET-32a-IRES-EGFP载体构建 | 第154-155页 |
| 2.8 T7 RNA聚合酶活性检测 | 第155-156页 |
| 2.9 荧光实时定量PCR检测MDBK-T7RNAP细胞系T7RNAP基因表达稳定性 | 第156-157页 |
| 2.10 Western blot检测MDBK-T7RNAP细胞系T7 RNA聚合酶活性的稳定性 | 第157页 |
| 2.11 成功构建E2 和NS4B定点突变的质粒p ACNR/NADL-E2M和p ACNR/NADL-NS4BM | 第157页 |
| 2.12 不同毒株的复制曲线 | 第157-158页 |
| 2.13 不同毒株的生长曲线 | 第158-159页 |
| 2.14 BVDV NADL E2M和NS4BM稳定性检测 | 第159-161页 |
| 2.15 不同毒株免疫产生小鼠Ig G抗体水平检测 | 第161-162页 |
| 3 讨论 | 第162-164页 |
| 3.1 正链RNA病毒的反向遗传学 | 第162-163页 |
| 3.2 负链RNA病毒的反向遗传学 | 第163页 |
| 3.3 反向遗传学构建的标记性疫苗 | 第163-164页 |
| 4 小结 | 第164-165页 |
| 第三部分 全文总结 | 第165-167页 |
| 创新点 | 第167-168页 |
| 参考文献 | 第168-192页 |
| 致谢 | 第192-193页 |
| 作者简介 | 第193-195页 |
| 导师评阅表 | 第195页 |
