| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-12页 |
| 第一章 绪论 | 第19-40页 |
| 1.1 腈水解酶类的概述 | 第19-27页 |
| 1.1.1 腈水解酶的来源和分类 | 第20-22页 |
| 1.1.2 腈水解酶的结构及其酶的作用机制 | 第22-24页 |
| 1.1.3 腈水解酶基因克隆与表达 | 第24-26页 |
| 1.1.4 腈水解酶的应用 | 第26-27页 |
| 1.1.4.1 在有机合成方面 | 第26-27页 |
| 1.1.4.2 生物降解方面 | 第27页 |
| 1.2 丙烯酸的生产方法和用途 | 第27-32页 |
| 1.2.1 丙烯酸生产方法 | 第27-30页 |
| 1.2.1.1 氰乙醇法 | 第27页 |
| 1.2.1.2 Reppe法 | 第27-28页 |
| 1.2.1.3 烯酮法 | 第28页 |
| 1.2.1.4 丙烯腈水解法 | 第28-29页 |
| 1.2.1.5 丙烯氧化法 | 第29页 |
| 1.2.1.6 丙烷氧化法生产丙烯酸 | 第29页 |
| 1.2.1.7 乳酸生产丙烯酸 | 第29-30页 |
| 1.2.2 丙烯酸及酯的主要用途 | 第30-31页 |
| 1.2.3 世界需求和产能 | 第31-32页 |
| 1.3 本论文的研究内容 | 第32-33页 |
| 参考文献 | 第33-40页 |
| 第二章 产腈水解酶菌种的筛选和鉴定 | 第40-51页 |
| 2.1 引言 | 第40-41页 |
| 2.2 材料与方法 | 第41-44页 |
| 2.2.1 土样 | 第41页 |
| 2.2.2 化学试剂与主要仪器 | 第41页 |
| 2.2.3 培养基 | 第41页 |
| 2.2.4 菌体制备及静息细胞转化 | 第41-42页 |
| 2.2.5 菌种的初筛 | 第42页 |
| 2.2.6 菌种的复筛 | 第42页 |
| 2.2.7 检测方法的建立及酶活单位的定义 | 第42-43页 |
| 2.2.8 菌落及细胞形态观察 | 第43页 |
| 2.2.9 生理生化试验 | 第43页 |
| 2.2.10 ATB仪器鉴定 | 第43页 |
| 2.2.11 16S rDNA的分子生物学鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.12 系统发育学分析 | 第44页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第44-48页 |
| 2.3.1 腈水解酶产生菌的筛选 | 第44页 |
| 2.3.2 菌株鉴定 | 第44-48页 |
| 2.3.2.1 形态特征 | 第44-45页 |
| 2.3.2.2 生理生化特征 | 第45-46页 |
| 2.3.2.3 16S rDNA序列的测定及系统发育分析 | 第46-48页 |
| 2.4 本章小结 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-51页 |
| 第三章 腈水解酶产生菌A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99产酶培养基及培养条件的优化 | 第51-69页 |
| 3.1 引言 | 第51页 |
| 3.2 材料与方法 | 第51-53页 |
| 3.2.1 菌种 | 第51页 |
| 3.2.2 培养基 | 第51-52页 |
| 3.2.3 主要仪器和试剂 | 第52页 |
| 3.2.4 菌体培养 | 第52页 |
| 3.2.5 菌体制备 | 第52页 |
| 3.2.6 生物量测定 | 第52页 |
| 3.2.7 静息细胞转化 | 第52页 |
| 3.2.8 分析方法和酶活的定义 | 第52-53页 |
| 3.2.9 响应面实验设计 | 第53页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第53-66页 |
| 3.3.1 发酵培养基组成的优化 | 第53-62页 |
| 3.3.1.1 碳源种类的筛选 | 第53-54页 |
| 3.3.1.2 碳源浓度的影响 | 第54页 |
| 3.3.1.3 氮源种类的选择 | 第54-56页 |
| 3.3.1.4 氮源浓度的影响 | 第56页 |
| 3.3.1.5 诱导剂种类、添加量的影响 | 第56-57页 |
| 3.3.1.6 添加金属离子对菌体生长和产酶的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.1.7 响应面分析优化菌株A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99发酵培养基 | 第58-62页 |
| 3.3.2 其它培养条件对菌体生长和产酶的影响 | 第62-65页 |
| 3.3.2.1 接种量对菌体的生长和产酶的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.2.2 装液量对菌体的生长和产酶的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.2.3 培养基初始pH值对菌体生长和产酶的影响 | 第64-65页 |
| 3.3.3 发酵生长曲线和产酶曲线的测定 | 第65-66页 |
| 3.4 本章小结 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-69页 |
| 第四章 A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99静息细胞催化丙烯腈生产丙烯酸反应条件的研究 | 第69-84页 |
| 4.1 引言 | 第69页 |
| 4.2 材料与方法 | 第69-71页 |
| 4.2.1 菌种与培养基 | 第69-70页 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 | 第70页 |
| 4.2.3 静息细胞的制备 | 第70页 |
| 4.2.4 静息细胞转化 | 第70-71页 |
| 4.2.5 分析方法及酶活的定义 | 第71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-81页 |
| 4.3.1 pH对A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99产酶的影响 | 第71-72页 |
| 4.3.2 反应温度对A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99酶活的影响 | 第72-74页 |
| 4.3.3 A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99腈水解酶的热稳定性 | 第74-75页 |
| 4.3.4 菌体浓度对A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99酶活的影响 | 第75-76页 |
| 4.3.5 A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99转化丙烯腈生产丙烯酸时间进程 | 第76-77页 |
| 4.3.6 A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99底物特异性 | 第77页 |
| 4.3.7 底物浓度 | 第77-78页 |
| 4.3.8 产物浓度 | 第78-79页 |
| 4.3.9 酶促反应动力学 | 第79-81页 |
| 4.4 本章小结 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-84页 |
| 第五章 固定化A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99静息细胞转化丙烯腈生产丙烯酸 | 第84-111页 |
| 5.1 引言 | 第84-85页 |
| 5.2 材料与方法 | 第85-90页 |
| 5.2.1 菌种与培养基 | 第85页 |
| 5.2.2 主要仪器和试剂 | 第85页 |
| 5.2.3 菌体的培养和静息细胞的制备 | 第85页 |
| 5.2.4 固定化静息细胞的制备方法 | 第85-86页 |
| 5.2.4.1 海藻酸钠包埋法 | 第85-86页 |
| 5.2.4.2 壳聚糖包埋法 | 第86页 |
| 5.2.4.3 琼脂凝胶包埋法 | 第86页 |
| 5.2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 | 第86页 |
| 5.2.4.5 明胶包埋法 | 第86页 |
| 5.2.4.6 蛋白包埋法 | 第86页 |
| 5.2.5 固定化静息细胞转化 | 第86-87页 |
| 5.2.6 固定化细胞酶活力计算方法 | 第87页 |
| 5.2.7 颗粒机械强度的测定 | 第87页 |
| 5.2.8 固定化包埋载体的选择 | 第87页 |
| 5.2.9 壳聚糖固定化静息细胞制备条件优化 | 第87-88页 |
| 5.2.9.1 壳聚糖浓度对酶活和颗粒强度的影响 | 第87-88页 |
| 5.2.9.2 三聚磷酸钠(TPP)浓度对酶活和颗粒强度的影响 | 第88页 |
| 5.2.9.3 包埋菌体量对酶活和颗粒强度的影响 | 第88页 |
| 5.2.9.4 固定化时间对酶活和颗粒强度的影响 | 第88页 |
| 5.2.10 海藻酸钠固定化静息细胞制备条件优化 | 第88-89页 |
| 5.2.10.1 海藻酸钠浓度对酶活的影响 | 第88页 |
| 5.2.10.2 CaCl_2浓度对酶活的影响 | 第88页 |
| 5.2.10.3 包埋菌体量对酶活的影响 | 第88-89页 |
| 5.2.10.4 颗粒大小对酶活的影响 | 第89页 |
| 5.2.10.5 钙化时间对酶活的影响 | 第89页 |
| 5.2.11 固定化静息细胞的转化条件研究 | 第89-90页 |
| 5.2.11.1 最佳转化体系和固定化静息细胞反应最适pH的确定 | 第89页 |
| 5.2.11.2 固定化静息细胞反应最适温度和热稳定性研究 | 第89页 |
| 5.2.11.3 固定化静息细胞批次转化制备丙烯酸 | 第89-90页 |
| 5.2.12 聚乙烯亚胺(PEI)和戊二醛(GA)强化海藻酸钠固定化颗粒 | 第90页 |
| 5.2.12.1 最佳强化条件的确定 | 第90页 |
| 5.2.13 固定化细胞颗粒电镜观察 | 第90页 |
| 5.3.结果与讨论 | 第90-107页 |
| 5.3.1 固定化包埋材料的选择 | 第90-91页 |
| 5.3.2 壳聚糖固定化静息细胞制备条件的优化 | 第91-95页 |
| 5.3.2.1 壳聚糖浓度对固定化静息细胞的酶活和机械强度的影响 | 第91-92页 |
| 5.3.2.2 三聚磷酸钠浓度对固定化静息细胞的酶活和机械强度的影响 | 第92-93页 |
| 5.3.2.3 菌体包埋量对转化的影响 | 第93-94页 |
| 5.3.2.4 固定时间的确定 | 第94-95页 |
| 5.3.3 海藻酸钠固定化静息细胞制备条件的优化 | 第95-98页 |
| 5.3.3.1 海藻酸钠浓度对酶活和颗粒强度的影响 | 第95页 |
| 5.3.3.2 CaCl_2浓度对酶活和颗粒强度的影响 | 第95-96页 |
| 5.3.3.3 菌体包埋量对转化的影响 | 第96-97页 |
| 5.3.3.4 固定化颗粒直径对转化的影响 | 第97-98页 |
| 5.3.3.5 海藻酸钠固定化时间的确定 | 第98页 |
| 5.3.4 固定化静息细胞转化条件的研究 | 第98-104页 |
| 5.3.4.1 最佳转化体系和反应最适pH值的确定 | 第98-99页 |
| 5.3.4.2 固定化静息细胞反应最适温度以及热稳定性研究 | 第99-101页 |
| 5.3.4.3 固定化静息细胞转化丙烯腈生产丙烯酸的进程曲线 | 第101页 |
| 5.3.4.4 固定化静息细胞使用批次 | 第101-102页 |
| 5.3.4.5 固定化颗粒形态观察 | 第102-103页 |
| 5.3.4.6 底物浓度对固定化静息细胞转化的影响 | 第103-104页 |
| 5.3.5 海藻酸钠颗粒的强化 | 第104-107页 |
| 5.3.5.1 聚乙烯亚胺(PEI)浓度 | 第104-105页 |
| 5.3.5.2 聚乙烯亚胺(PEI)处理时CaCl_2浓度 | 第105-106页 |
| 5.3.5.3 戊二醛(GA)浓度 | 第106页 |
| 5.3.5.4 海藻酸钠颗粒强化前后重复使用批次的研究 | 第106-107页 |
| 5.3.5.5 强化前后颗粒表面扫描电镜图 | 第107页 |
| 5.4 本章小结 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-111页 |
| 第六章 固定化A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99细胞碎片转化丙烯腈生产丙烯酸 | 第111-125页 |
| 6.1 引言 | 第111页 |
| 6.2 材料与方法 | 第111-115页 |
| 6.2.1 菌种与培养基 | 第111-112页 |
| 6.2.3 主要仪器和试剂 | 第112页 |
| 6.2.4 菌体的培养 | 第112页 |
| 6.2.5 细胞的破碎方法 | 第112页 |
| 6.2.6 固定化细胞碎片的制备方法 | 第112-113页 |
| 6.2.6.1 海藻酸钠包埋法 | 第112页 |
| 6.2.6.2 壳聚糖包埋法 | 第112-113页 |
| 6.2.7 固定化细胞碎片的转化 | 第113页 |
| 6.2.8 壳聚糖固定化细胞碎片制备条件优化 | 第113页 |
| 6.2.8.1 壳聚糖浓度 | 第113页 |
| 6.2.8.2 三聚磷酸钠浓度 | 第113页 |
| 6.2.8.3 包埋菌体量 | 第113页 |
| 6.2.8.4 固定化时间 | 第113页 |
| 6.2.9 海藻酸钠固定化细胞碎片制备条件优化 | 第113-114页 |
| 6.2.9.1 海藻酸钠浓度 | 第113-114页 |
| 6.2.9.2 CaCl_2浓度 | 第114页 |
| 6.2.9.3 包埋菌体量 | 第114页 |
| 6.2.9.4 颗粒直径大小 | 第114页 |
| 6.2.10 固定化细胞碎片的转化条件研究 | 第114-115页 |
| 6.2.10.1 最佳转化体系和固定化细胞碎片反应最适pH的确定 | 第114页 |
| 6.2.10.2 pH稳定性 | 第114页 |
| 6.2.10.3 固定化菌体碎片反应最适温度和热稳定性研究 | 第114-115页 |
| 6.2.10.4 固定化细胞碎片转化丙烯腈生产丙烯酸 | 第115页 |
| 6.2.10.5 固定化菌体碎片批次转化制备丙烯酸 | 第115页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第115-123页 |
| 6.3.1 细胞破碎与碎片固定化 | 第115-116页 |
| 6.3.2 壳聚糖固定化细胞碎片制备条件优化 | 第116-118页 |
| 6.3.3 海藻酸钠固定化细胞碎片制备条件优化 | 第118-119页 |
| 6.3.4 固定化细胞碎片转化条件优化 | 第119-123页 |
| 6.3.4.1 最适反应体系和最佳pH值的确定 | 第119-120页 |
| 6.3.4.2 pH稳定性 | 第120页 |
| 6.3.4.3 温度对固定化细胞碎片催化活力的影响 | 第120-122页 |
| 6.3.4.4 固定化细胞碎片和固定化静息细胞转化进程曲线 | 第122页 |
| 6.3.4.4 固定化细胞碎片的反应批次 | 第122-123页 |
| 6.4 本章小结 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-125页 |
| 第七章 A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99 腈水解酶基因克隆与表达 | 第125-141页 |
| 7.1 引言 | 第125-126页 |
| 7.2 材料和方法 | 第126-131页 |
| 7.2.1 质粒与菌株 | 第126-127页 |
| 7.2.2 工具酶和试剂 | 第127页 |
| 7.2.3 培养基 | 第127页 |
| 7.2.4 主要仪器 | 第127页 |
| 7.2.5 A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99腈水解酶基因的克隆 | 第127-129页 |
| 7.2.5.1 Arthrobacter sp.基因组DNA的提取 | 第127页 |
| 7.2.5.2 PCR反应条件 | 第127页 |
| 7.2.5.3 CaCl_2感受态细胞的制备及转化 | 第127-128页 |
| 7.2.5.4 大肠杆菌重组质粒的粗提试剂及方法 | 第128-129页 |
| 7.2.5.5 连接、转化和筛选以及验证 | 第129页 |
| 7.2.5.6 重组质粒的序列测定 | 第129页 |
| 7.2.6 Arthrobacter Sp.腈水解酶基因的表达 | 第129-131页 |
| 7.2.6.1 含有腈水解酶基因的重组质粒的抽提 | 第129页 |
| 7.2.6.2 目的基因的扩增 | 第129-130页 |
| 7.2.6.3 PCR产物的纯化 | 第130页 |
| 7.2.6.4 外源基因及质粒的酶切 | 第130-131页 |
| 7.2.6.5 外源基因与质粒的连接 | 第131页 |
| 7.2.6.6 表达重组质粒转化大肠杆菌及酶切鉴定 | 第131页 |
| 7.2.6.7 诱导表达 | 第131页 |
| 7.2.7 表达产物SDS-PAGE分析 | 第131页 |
| 7.2.8 酶活检测方法 | 第131页 |
| 7.3 结果和讨论 | 第131-139页 |
| 7.3.1 腈水解酶基因的提取和克隆 | 第131-133页 |
| 7.3.2 大肠杆菌胞内表达载体的构建 | 第133-135页 |
| 7.3.3 大肠杆菌分泌表达载体的构建 | 第135-137页 |
| 7.3.4 重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT胞内表达腈水解酶 | 第137-139页 |
| 7.3.4.1 重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT SDS-PAGE | 第137-138页 |
| 7.3.4.2 重组大肠杆菌胞内表达腈水解酶活力测定 | 第138-139页 |
| 7.3.5 重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-NIT分泌表达腈水解酶 | 第139页 |
| 7.4 本章小结 | 第139-140页 |
| 参考文献 | 第140-141页 |
| 第八章 总结与展望 | 第141-144页 |
| 8.1 总结 | 第141-143页 |
| 8.2 展望 | 第143-144页 |
| 附录 | 第144-148页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
