| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 一 文献综述 | 第12-20页 |
| 1 引言 | 第12页 |
| 2 研究背景 | 第12-16页 |
| 2.1 昆虫病原真菌的侵染机制 | 第12-16页 |
| 3 昆虫病原真菌的应用 | 第16-17页 |
| 3.1 不同真菌的杀虫作用 | 第16-17页 |
| 3.2 真菌代谢产物的其他作用 | 第17页 |
| 4 昆虫病原真菌的发展前景 | 第17-18页 |
| 4.1 基因工程技术对菌株致病力提高的改造 | 第18页 |
| 4.2 通过与其他其它微生物杀虫剂或农药配合使用以增强致病力 | 第18页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第18-20页 |
| 二 玫烟色拟青霉几丁质酶产量提高的条件优化和几丁质酶基因CHIT2的克隆、重组质粒构建及表达 | 第20-54页 |
| 1 材料 | 第20页 |
| 2 主要仪器及试剂 | 第20-22页 |
| 2.1 主要仪器 | 第20页 |
| 2.2 实验试剂 | 第20-21页 |
| 2.3 主要培养基 | 第21-22页 |
| 3 实验方法 | 第22-38页 |
| 3.1 玫烟色拟青霉几丁质酶产酶量提高的条件优化 | 第22-24页 |
| 3.1.1 胶体几丁质的制备 | 第22-23页 |
| 3.1.2 N-乙酰葡萄糖胺(NAG)标准曲线的制定 | 第23页 |
| 3.1.3 几丁质酶的诱导 | 第23页 |
| 3.1.4 几丁质酶活性的测定 | 第23-24页 |
| 3.2 玫烟色拟青霉几丁质酶基因CHIT2的克隆 | 第24-32页 |
| 3.2.1 玫烟色拟青霉菌丝的制备 | 第24页 |
| 3.2.2 玫烟色拟青霉菌丝RNA的提取 | 第24-25页 |
| 3.2.3 玫烟色拟青霉DNA的提取 | 第25-26页 |
| 3.2.4 玫烟色拟青霉的cDNA合成 | 第26页 |
| 3.2.5 cDNA的特异片段的扩增 | 第26-27页 |
| 3.2.6 割胶回收 | 第27-28页 |
| 3.2.7 连接转化 | 第28页 |
| 3.2.8 PCR方法鉴定阳性重组子 | 第28-29页 |
| 3.2.9 测序与分析 | 第29页 |
| 3.2.10 RACE模板的合成 | 第29-30页 |
| 3.2.11 cDNA 3'端及5'端的RACE-PCR扩增 | 第30-32页 |
| 3.2.12 玫烟色拟青霉几丁质酶基因Pfuchit2 cDNA全长及结构基因克隆 | 第32页 |
| 3.2.13 序列分析 | 第32页 |
| 3.3 几丁质酶基因CHIT2重组质粒构建 | 第32-36页 |
| 3.3.1 几丁质酶基因Pfchit2 PET-28a、PET-32a,PPICZB载体的构建 | 第32-33页 |
| 3.3.2 质粒的制备 | 第33-34页 |
| 3.3.3 含有口的片段质粒的酶切及纯化 | 第34-35页 |
| 3.3.4 表达载体的制备 | 第35页 |
| 3.3.5 酶切后的载体与目的片段的连接与转化 | 第35页 |
| 3.3.6 pPICZB-chit2重组载体单酶切线性化 | 第35页 |
| 3.3.7 毕赤酵母的化学转化 | 第35-36页 |
| 3.3.7.1 酵母感受态细胞制备 | 第35-36页 |
| 3.3.7.2 转化 | 第36页 |
| 3.2.8 PCR鉴定表达重组子 | 第36页 |
| 3.4 重组菌的表达 | 第36-38页 |
| 3.4.1 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第36-37页 |
| 3.4.2 毕赤酵母重组菌的诱导表达 | 第37页 |
| 3.4.3 细胞总蛋白的提取 | 第37页 |
| 3.4.4 重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第37-38页 |
| 3.4.5 包涵体蛋白的纯化与复性 | 第38页 |
| 4 结果分析 | 第38-54页 |
| 4.1 玫烟色拟青霉产几丁质酶条件优化 | 第38-41页 |
| 4.1.1 NAG标准曲线 | 第38-39页 |
| 4.1.2 玫烟色拟青霉几丁质酶产量(酶活)最佳测定时间 | 第39-40页 |
| 4.1.3 几丁质酶性质的鉴定 | 第40-41页 |
| 4.1.4 不同碳氮源对产酶的影响 | 第41页 |
| 4.2 玫烟色拟青霉几丁质酶基因CHIT2的克隆 | 第41-48页 |
| 4.2.1 RNA的提取 | 第41-42页 |
| 4.2.2 特异性片段的扩增 | 第42页 |
| 4.2.3 玫烟色拟青霉几丁质酶chit2基因全长cDNA的克隆 | 第42-43页 |
| 4.2.4 玫烟色拟青霉chit2基因cDNA序列及结构基因的分析 | 第43-46页 |
| 4.2.5 序列同源性比较 | 第46-48页 |
| 4.3 几丁质酶基因CHIT2重组质粒构建 | 第48-50页 |
| 4.3.1 Pfchit2 PCR扩增和表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 4.3.2 表达载体的鉴定 | 第50页 |
| 4.4 重组菌的诱导表达与纯化 | 第50-54页 |
| 4.4.1 Ifchit2基因在大肠杆菌BL21的表达 | 第51-52页 |
| 4.4.2 Pfchit2基因在酵母GS115的表达 | 第52-53页 |
| 4.4.3 包涵体的提取,纯化与复性 | 第53-54页 |
| 三 玫烟色拟青霉类枯草蛋白酶基因PR1的克隆和分析 | 第54-68页 |
| 1 主要材料 | 第54页 |
| 2 主要仪器、主要试剂、培养基 | 第54页 |
| 3 实验方法 | 第54-57页 |
| 3.1 玫烟色拟青霉类枯草蛋白酶基因PR1的克隆 | 第54-55页 |
| 3.1.1 玫烟色拟青霉类枯草蛋白酶基因cDNA特异片段的扩增 | 第54-55页 |
| 3.1.2 测序分析 | 第55页 |
| 3.1.3 Pr1基因5'端和3'端引物设计 | 第55页 |
| 3.1.4 Pr1基因cDNA 3'端及5'端的RACE-PCR扩增 | 第55页 |
| 3.1.5 玫烟色拟青霉类枯草蛋白酶PfuPr1 cDNA全长及结构基因的克隆 | 第55页 |
| 3.1.6 分析序列 | 第55页 |
| 3.2 蛋白酶基因PR1重组质粒构建 | 第55-57页 |
| 3.2.1 蛋白酶PfPr1 pET-28a、pET-32a和pPICZB载体的构建 | 第56页 |
| 3.2.2 质粒制备 | 第56页 |
| 3.2.3 含有目的片段质粒的酶切及纯化 | 第56页 |
| 3.2.4 表达载体制备 | 第56页 |
| 3.2.5 酶切后的载体与目的片段的连接与转化 | 第56-57页 |
| 3.2.6 pPICZB-pr1重组载体单酶切线性化 | 第57页 |
| 3.2.7 毕赤酵母的化学转化 | 第57页 |
| 3.2.8 PCR鉴定表达重组子 | 第57页 |
| 3.3 重组菌的表达 | 第57页 |
| 4 结果分析 | 第57-68页 |
| 4.1 玫烟色拟青霉蛋白酶基因PR1的克隆 | 第57-64页 |
| 4.1.1 基因特异性片段的实时定量PCR扩增 | 第57-58页 |
| 4.1.2 玫烟色拟青霉类枯草蛋白酶Pr15'/3'-RACE扩增 | 第58-59页 |
| 4.1.3 玫烟色拟青霉Pr1基因cDNA序列分析 | 第59-62页 |
| 4.1.4 序列同源性比较 | 第62-64页 |
| 4.2 表达载体的构建 | 第64-65页 |
| 4.2.1 Pf Pr1 PCR扩增和表达载体的构建 | 第64-65页 |
| 4.2 表达载体的鉴定 | 第65页 |
| 4.2.1 大肠杆菌表达载体的鉴定 | 第65页 |
| 4.2.2 pPICZB-Pf Pr1 PCR扩增鉴定 | 第65页 |
| 4.3 PF PR1重组菌的诱导表达与纯化 | 第65-68页 |
| 4.3.1 Pf Pr1蛋白在大肠杆菌BL21的表达 | 第66页 |
| 4.3.2 Pf Pr1基因在毕赤酵母GS115表达 | 第66-67页 |
| 4.3.3 Pr1重组蛋白包涵体的提取,纯化与复性 | 第67-68页 |
| 四 讨论 | 第68-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 在读研究生期间论文发表情况 | 第76页 |
| 申请专利 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
