| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章：绪论 | 第13-25页 |
| 1.1 细胞色素P450概述 | 第13-18页 |
| 1.1.1 细胞色素P450的命名 | 第13-14页 |
| 1.1.2 细胞色素P450的分布 | 第14-15页 |
| 1.1.3 细胞色素P450的结构特征 | 第15-16页 |
| 1.1.4 细胞色素P450的催化机理 | 第16-18页 |
| 1.1.5 细胞色素P450的功能 | 第18页 |
| 1.2 细菌细胞色素P450 | 第18-20页 |
| 1.3 细菌CYP450的异源表达系统 | 第20-21页 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 | 第20页 |
| 1.3.2 酵母异源表达系统 | 第20-21页 |
| 1.4 细胞色素P450的应用 | 第21-23页 |
| 1.4.1 细胞色素P450在医药上的应用 | 第21页 |
| 1.4.2 细胞色素P450在生物合成方面的应用 | 第21-22页 |
| 1.4.3 细胞色素P450在农业方面的应用[40-41] | 第22页 |
| 1.4.4 CYP450酶在环境保护中的应用 | 第22-23页 |
| 1.5 本研究的研究意义与主要内容 | 第23-25页 |
| 1.5.1 本研究的研究意义 | 第23-24页 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 | 第24-25页 |
| 第二章：细胞色素P45O酶基因的克隆与表达 | 第25-43页 |
| 2.1 材料 | 第25-29页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.2 分子生物学试剂和试剂盒 | 第25-26页 |
| 2.1.3 化学试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.4 培养基和缓冲液的配制 | 第27-28页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.2 试验方法 | 第29-35页 |
| 2.2.1 DC-12菌株的活化与基因组的提取 | 第29页 |
| 2.2.2 DC-12 细胞色素 P450 基因的克隆与测序 | 第29-31页 |
| 2.2.3 重组质粒pET22b(+)-CYP450的构建 | 第31-32页 |
| 2.2.4 重组质粒pET22b(+)-CYP450转化E.coli | 第32页 |
| 2.2.4.1 重组质粒的转化 | 第32页 |
| 2.2.4.2 菌液 PCR 验证阳性克隆 | 第32页 |
| 2.2.5 大肠杆菌BL21-pET22b(+)-CYP450的表达 | 第32-33页 |
| 2.2.6 CYP450粗酶液的制备及Ni~(2+)亲和层析纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.7 SDS-PAGE | 第34-35页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第35-41页 |
| 2.3.1 DC-12细胞色素P450基因序列结构特征 | 第35-36页 |
| 2.3.2 细胞色素P450基因的克隆 | 第36-37页 |
| 2.3.3 细胞色素P450基因的表达与纯化 | 第37-41页 |
| 2.4 小结 | 第41-43页 |
| 第三章：CYP450的发酵条件优化及酶学性质研究 | 第43-60页 |
| 3.1 材料 | 第43-44页 |
| 3.1.1 菌种 | 第43页 |
| 3.1.2 材料及试剂 | 第43页 |
| 3.1.3 反应缓冲液 | 第43页 |
| 3.1.4 仪器设备 | 第43-44页 |
| 3.2 发酵条件优化 | 第44-47页 |
| 3.2.1 大肠杆菌E.coli-pET22b(+)-CYP450的转接活化 | 第44页 |
| 3.2.2 诱导剂浓度对CYP450酶活力的影响 | 第44页 |
| 3.2.3 诱导时间对CYP450酶活力的影响 | 第44页 |
| 3.2.4 诱导温度对CYP450酶活力的影响 | 第44-45页 |
| 3.2.5 诱导OD600对CYP450酶活力的影响 | 第45页 |
| 3.2.6 重组CYP450酶活力测定方法 | 第45-46页 |
| 3.2.7 蛋白质浓度的测定 | 第46-47页 |
| 3.3 酶学性质研究试验方法 | 第47-50页 |
| 3.3.1 CYP450酶多样底物的研究 | 第47页 |
| 3.3.2 温度对CYP450酶酶活的影响 | 第47页 |
| 3.3.3 pH对CYP450酶酶活的影响 | 第47页 |
| 3.3.4 不同离子及其浓度对CYP450酶酶活的影响 | 第47-48页 |
| 3.3.5 表面活性剂及其浓度对CYP450酶酶活的影响 | 第48页 |
| 3.3.6 对硝基苯酚、7-hydroxycoumarin、BSA标准曲线 | 第48-50页 |
| 3.4 实验结果 | 第50-58页 |
| 3.4.1 诱导剂浓度对CYP450酶活性表达量的影响 | 第50页 |
| 3.4.2 诱导时间对CYP450酶活性表达量的影响 | 第50-51页 |
| 3.4.3 诱导温度对CYP450酶活性表达量的影响 | 第51-52页 |
| 3.4.4 诱导OD600对CYP450酶活性表达量的影响 | 第52-53页 |
| 3.4.5 CYP450酶多样底物的研究结果 | 第53-54页 |
| 3.4.6 温度对CYP450酶酶活的影响 | 第54-55页 |
| 3.4.7 pH对CYP450酶酶活力的影响 | 第55-56页 |
| 3.4.8 不同离子及其浓度对CYP450酶酶活力的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.9 表面活性剂及其浓度对CYP450酶活力的影响 | 第57-58页 |
| 3.5 小结 | 第58-60页 |
| 第四章：解淀粉芽孢杆菌DC-12 CYP450基因缺失质粒的构建 | 第60-68页 |
| 4.1 材料 | 第60-61页 |
| 4.1.1 菌种 | 第60页 |
| 4.1.2 实验试剂与仪器 | 第60页 |
| 4.1.3 培养基与缓冲液的配制 | 第60-61页 |
| 4.2 试验方法 | 第61-64页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第61页 |
| 4.2.2 PCR扩增DFE-up、DFE-down | 第61-62页 |
| 4.2.3 PCR扩增 同源臂tyb | 第62页 |
| 4.2.4 目的基因与pMD18-T载体的连接及序列测定 | 第62页 |
| 4.2.5 重组质粒pSKV7-tyb的构建 | 第62页 |
| 4.2.6 重组质粒转化E. coli DH5α 和JM110 | 第62页 |
| 4.2.7 细胞色素P450基因的敲除 | 第62-64页 |
| 4.3 试验结果与分析 | 第64-67页 |
| 4.3.1 扩增DFE-up、DFE-down | 第64-65页 |
| 4.3.2 构建同源臂tyb | 第65-66页 |
| 4.3.3 重组质粒pSKV7-tyb转化大肠杆菌DH5α和JM110 | 第66-67页 |
| 4.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 结论与展望 | 第68-71页 |
| 结论 | 第68-69页 |
| 展望 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 附件 | 第78页 |
