| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第16-24页 |
| 1.1 手性药物 | 第16-17页 |
| 1.1.1 手性药物研究现状 | 第16页 |
| 1.1.2 手性药物制备方法 | 第16-17页 |
| 1.2 两种手性药物中间体 | 第17-19页 |
| 1.2.1 孟鲁司特钠及其中间体 | 第17-18页 |
| 1.2.2 依折麦布及其中间体 | 第18-19页 |
| 1.3 羰基还原酶概述 | 第19-20页 |
| 1.3.1 羰基还原酶简介 | 第19页 |
| 1.3.2 羰基还原酶的应用 | 第19-20页 |
| 1.4 分子模拟及酶分子半理性设计 | 第20-22页 |
| 1.4.1 分子模拟概述 | 第20页 |
| 1.4.2 酶分子半理性设计 | 第20-22页 |
| 1.5 本课题研究意义及内容 | 第22-24页 |
| 第二章 羰基还原酶kred的克隆及其在大肠杆菌和毕赤酵母中表达 | 第24-44页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验仪器及材料(见附录) | 第24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-33页 |
| 2.3.1 羰基还原酶kred的基因获取 | 第24页 |
| 2.3.2 大肠杆菌表达载体pET 22b-kred重组质粒的构建 | 第24-27页 |
| 2.3.3 pET 22b-kred大肠杆菌工程菌的诱导表达 | 第27-28页 |
| 2.3.4 毕赤酵母表达载体pPIC9K-kred的构建 | 第28-30页 |
| 2.3.5 pPIC9K-kred重组质粒的线性化 | 第30-31页 |
| 2.3.6 毕赤酵母基因工程菌的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.7 毕赤酵母基因工程菌诱导表达 | 第32页 |
| 2.3.8 菌体生长曲线测定及蛋白表达检测 | 第32页 |
| 2.3.9 kred不对称还原合成孟鲁司特钠中间体 | 第32-33页 |
| 2.4 结果分析与讨论 | 第33-43页 |
| 2.4.1 pET 22b-kred重组质粒构建 | 第33-36页 |
| 2.4.2 大肠杆菌基因工程菌的诱导表达 | 第36页 |
| 2.4.3 pPIC9K-kred重组质粒构建 | 第36-38页 |
| 2.4.4 pPIC9K-kred重组质粒线性化 | 第38-39页 |
| 2.4.5 毕赤酵母基因工程菌的构建 | 第39-41页 |
| 2.4.6 生长曲线测定 | 第41页 |
| 2.4.7 毕赤酵母基因工程菌蛋白表达检测 | 第41-42页 |
| 2.4.8 kred不对称还原孟鲁司特钠中间体 | 第42-43页 |
| 2.5 本章小结 | 第43-44页 |
| 第三章 羰基还原酶kred分子模拟 | 第44-52页 |
| 3.1 引言 | 第44页 |
| 3.2 实验仪器及软件 | 第44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-45页 |
| 3.3.1 同源建模 | 第44页 |
| 3.3.2 分子对接 | 第44-45页 |
| 3.3.3 能量最小化 | 第45页 |
| 3.4 结果分析与讨论 | 第45-50页 |
| 3.4.1 同源建模 | 第45-46页 |
| 3.4.2 kred与辅酶NADPH对接及能量最小化 | 第46-48页 |
| 3.4.3 酶-辅酶复合物与底物对接 | 第48页 |
| 3.4.4 对接洞穴分析 | 第48-50页 |
| 3.5 本章小结 | 第50-52页 |
| 第四章 羰基还原酶kred定点突变 | 第52-60页 |
| 4.1 引言 | 第52页 |
| 4.2 实验仪器与材料(见附录) | 第52页 |
| 4.3 实验方法 | 第52-55页 |
| 4.3.1 突变引物设计 | 第52-53页 |
| 4.3.2 突变重组质粒的获得 | 第53-54页 |
| 4.3.3 蛋白表达 | 第54页 |
| 4.3.4 突变后蛋白活性检测 | 第54-55页 |
| 4.4 结果分析与讨论 | 第55-58页 |
| 4.4.1 突变重组质粒的获得 | 第55-56页 |
| 4.4.2 突变后蛋白活性检测 | 第56-58页 |
| 4.5 本章小结 | 第58-60页 |
| 第五章 新型生物催化剂不对称还原合成依折麦布中间体 | 第60-70页 |
| 5.1 引言 | 第60页 |
| 5.2 实验仪器及材料(见附录) | 第60页 |
| 5.3 实验方法 | 第60-62页 |
| 5.3.1 依折麦布中间体外消旋体的合成 | 第60-61页 |
| 5.3.2 最适反应温度测定 | 第61页 |
| 5.3.3 最适反应pH测定 | 第61页 |
| 5.3.4 反应时间曲线测定 | 第61页 |
| 5.3.5 反应菌体浓度测定 | 第61-62页 |
| 5.3.6 金属离子影响测定 | 第62页 |
| 5.4 结果分析与讨论 | 第62-68页 |
| 5.4.1 依折麦布中间体外消旋体的合成及检测 | 第62-63页 |
| 5.4.2 大肠杆菌活性检测 | 第63-64页 |
| 5.4.3 最适反应温度测定 | 第64-65页 |
| 5.4.4 最适反应pH测定 | 第65-66页 |
| 5.4.5 反应时间曲线测定 | 第66页 |
| 5.4.6 反应菌体浓度测定 | 第66-67页 |
| 5.4.7 金属离子影响测定 | 第67-68页 |
| 5.5 本章小结 | 第68-70页 |
| 第六章 总结与展望 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 附录 | 第76-90页 |
| 致谢 | 第90-92页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第92-94页 |
| 作者与导师简介 | 第94-95页 |
| 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第95-96页 |
