| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语表 | 第14-20页 |
| 1. 绪论 | 第20-34页 |
| 1.1 研究背景及意义 | 第20-24页 |
| 1.2 细胞色素P450(CYP105D7)国内外研究现状 | 第24-31页 |
| 1.2.1 细胞色素P450的基本分类 | 第24-25页 |
| 1.2.2 细胞色素P450的晶体结构研究 | 第25-27页 |
| 1.2.3 细胞色素P450识别、结合底物的“诱导-契合机制” | 第27-28页 |
| 1.2.4 CYP105D7的底物宽泛性研究 | 第28-29页 |
| 1.2.5 美伐他汀作为底物的研究 | 第29-30页 |
| 1.2.6 还原伴侣蛋白的选择与应用 | 第30-31页 |
| 1.2.7 高效率电子传递偶合体系 | 第31页 |
| 1.3 研究目标与技术难点 | 第31-32页 |
| 1.4 研究内容和所要解决的问题 | 第32-33页 |
| 1.5 本章小结 | 第33-34页 |
| 2. CYP105D7介导美伐他汀体外生物转化 | 第34-65页 |
| 2.1 引言 | 第34页 |
| 2.2 总体方案设计 | 第34页 |
| 2.3 实验材料及仪器 | 第34-39页 |
| 2.3.1 实验仪器 | 第34-36页 |
| 2.3.2 实验材料 | 第36-39页 |
| 2.4 研究方法 | 第39-54页 |
| 2.4.1 大肠杆菌化学感受态的制备与转化 | 第39-40页 |
| 2.4.1.1 大肠杆菌化学感受态的制备 | 第39-40页 |
| 2.4.1.2 大肠杆菌化学感受态的转化 | 第40页 |
| 2.4.2 CYP105D7,Pdx/Pdr, seFdx/seFdR,RhFRED,GDH蛋白表达和纯化 | 第40-47页 |
| 2.4.2.1 培养基 | 第40-41页 |
| 2.4.2.2 溶液 | 第41-44页 |
| 2.4.2.3 蛋白表达 | 第44-45页 |
| 2.4.2.4 蛋白纯化 | 第45-47页 |
| 2.4.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测CYP105D7表达实验 | 第47-49页 |
| 2.4.4 CO结合差光谱实验 | 第49-51页 |
| 2.4.4.1 CYP105D7浓度测定 | 第49-50页 |
| 2.4.4.2 美伐他汀与CYP105D7滴定实验 | 第50-51页 |
| 2.4.5 美伐他汀内酯开环实验 | 第51页 |
| 2.4.6 还原伴侣蛋白浓度测定 | 第51-52页 |
| 2.4.6.1 铁氧还蛋白浓度测定 | 第51-52页 |
| 2.4.6.2 铁氧还蛋白还原酶浓度测定 | 第52页 |
| 2.4.7 CYP105D7与美伐他汀的体外生物转化实验 | 第52-53页 |
| 2.4.8 RP-HPLC和HR-ESI-MS分析检测 | 第53页 |
| 2.4.9 美伐他汀与CYP105D7的分子模拟 | 第53-54页 |
| 2.4.10 Pdx/Pdr支撑CYP105D7的稳态动力学分析 | 第54页 |
| 2.5 结果与讨论 | 第54-64页 |
| 2.5.1 CYP105D7,Pdx/Pdr, seFdx/seFdR,RhFRED,GDH蛋白表达SDS-PAGE分析 | 第54-56页 |
| 2.5.2 CYP105D7紫外吸收光谱分析 | 第56-57页 |
| 2.5.3 美伐他汀与CYP105D7亲和力分析 | 第57-58页 |
| 2.5.4 三对还原伴侣支撑CYP105D7羟基化美伐他汀的HPLC、LC-ESI-MS分析 | 第58-61页 |
| 2.5.5 美伐他汀与CYP105D7的分子模拟分析 | 第61-62页 |
| 2.5.6 Pdx/Pdr支撑下美伐他汀、双氯芬酸钠与CYP105D7的动力学参数分析比较 | 第62-64页 |
| 2.6 本章小结 | 第64-65页 |
| 3. CYP105D7介导美伐他汀全细胞生物转化 | 第65-89页 |
| 3.1 引言 | 第65页 |
| 3.2 总体方案设计 | 第65-67页 |
| 3.3 实验试剂及仪器 | 第67-69页 |
| 3.3.1 实验仪器 | 第67页 |
| 3.3.2 实验材料 | 第67-69页 |
| 3.4 研究方法 | 第69-79页 |
| 3.4.1 N/C端His_6标记的CYP105D7载体的构建 | 第69-73页 |
| 3.4.1.1 菌株和质粒 | 第69-70页 |
| 3.4.1.2 目的基因和引物 | 第70页 |
| 3.4.1.3 基因克隆及重组载体的构建 | 第70-73页 |
| 3.4.2 CYP105D7-N-His_6蛋白表达和纯化 | 第73页 |
| 3.4.3 SDS-PAGE检测CYP105D7-N-His_6表达实验 | 第73页 |
| 3.4.4 CYP105D7-N-His_6的CO结合紫外吸收光谱实验 | 第73页 |
| 3.4.5 融合蛋白CYP105D7-N-His_6-RhFRED高效率电子传递系统的构建 | 第73-76页 |
| 3.4.5.1 菌株和质粒 | 第73页 |
| 3.4.5.2 目的基因和引物 | 第73-74页 |
| 3.4.5.3 基因克隆及重组载体的构建 | 第74-76页 |
| 3.4.6 融合蛋白CYP105D7-N-His_6-RhFRED的表达和纯化 | 第76页 |
| 3.4.7 SDS-PAGE检测CYP105D7-N-His_6-RhFRED表达实验 | 第76页 |
| 3.4.8 CYP105D7-N-His_6-RhFRED的CO结合紫外吸收光谱实验 | 第76页 |
| 3.4.9 CYP105D7-C-His_4-CamA/B对美伐他汀的全细胞催化实验 | 第76-79页 |
| 3.4.9.1 培养基 | 第76-77页 |
| 3.4.9.2 溶液 | 第77-78页 |
| 3.4.9.3 全细胞催化实验 | 第78-79页 |
| 3.4.10 CYP105D7-N-His_6-RhFRED对美伐他汀的全细胞催化实验 | 第79页 |
| 3.5 结果与讨论 | 第79-88页 |
| 3.5.1 酶切重组结果分析 | 第79-81页 |
| 3.5.2 CYP105D7-N-His_6蛋白表达SDS-PAGE分析 | 第81页 |
| 3.5.3 CYP105D7-N-His_6紫外吸收光谱分析 | 第81-82页 |
| 3.5.4 一步克隆构建结果分析 | 第82-84页 |
| 3.5.5 CYP105D7-N-His_6-RhFRED蛋白表达SDS-PAGE分析 | 第84-85页 |
| 3.5.6 CYP105D7-N-His_6-RhFRED紫外吸收光谱分析 | 第85页 |
| 3.5.7 CYP105D7-C-His_4-CamA/B对美伐他汀的全细胞催化分析 | 第85-87页 |
| 3.5.8 CYP105D7-N-His_6-RhFRED对美伐他汀的全细胞催化分析 | 第87-88页 |
| 3.6 本章小结 | 第88-89页 |
| 4. 总结与展望 | 第89-93页 |
| 4.1 研究总结 | 第89-91页 |
| 4.2 存在问题总结以及工作展望 | 第91-93页 |
| 4.2.1 存在问题总结 | 第91页 |
| 4.2.2 工作展望 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-102页 |
| 附录 | 第102-106页 |
| 作者简历 | 第106页 |
