| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第1章 前言 | 第11-19页 |
| 1.1 研究背景及理论依据 | 第11-12页 |
| 1.1.1 基因敲除技术的发展历程 | 第11页 |
| 1.1.2 新型基因敲除技术 | 第11-12页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统的研究概述 | 第12-16页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统的发现历史 | 第12-13页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统的结构及分类 | 第13-14页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制 | 第14-15页 |
| 1.2.4 体外人工构建CRISPR/Cas9基因编辑系统 | 第15-16页 |
| 1.3 生长抑素概述 | 第16-19页 |
| 1.3.1 生长抑素的发现、结构及分布 | 第16-17页 |
| 1.3.2 生长抑素的生理功能及作用机制 | 第17页 |
| 1.3.3 生长抑素在畜牧生产中的应用 | 第17-19页 |
| 第2章 CRISPR/Cas9系统敲除靶点的设计、合成及活性检测 | 第19-29页 |
| 2.1 材料试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.1 主要仪器及耗材 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第19-20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-24页 |
| 2.2.1 sgRNA靶点设计及寡核苷酸链合成 | 第20页 |
| 2.2.2 sgRNA表达载体构建及鉴定 | 第20-22页 |
| 2.2.3 sgRNA靶点活性检测 | 第22-24页 |
| 2.3 实验结果 | 第24-26页 |
| 2.3.1 sgRNA表达质粒测序结果 | 第24-25页 |
| 2.3.2 sgRNA体外转录结果 | 第25-26页 |
| 2.3.3 sgRNA重组质粒载体活性检测 | 第26页 |
| 2.4 讨论 | 第26-29页 |
| 第3章 sgRNA表达质粒电转染PK15细胞后SST基因的突变检测 | 第29-39页 |
| 3.1 材料试剂 | 第29-31页 |
| 3.1.1 主要仪器及耗材 | 第29页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第29-30页 |
| 3.1.3 主要溶液配制 | 第30-31页 |
| 3.2 实验方法 | 第31-34页 |
| 3.2.1 PK15细胞的培养 | 第31-32页 |
| 3.2.2 sgRNA表达质粒的构建及电穿孔转染PK15细胞 | 第32-33页 |
| 3.2.3 筛选建立单克隆细胞株 | 第33-34页 |
| 3.2.4 T7NE1酶切检测及测序分析 | 第34页 |
| 3.3 结果和分析 | 第34-36页 |
| 3.3.1 电穿孔转染情况及单克隆挑选 | 第34-35页 |
| 3.3.2 Cas9/sgRNA介导的SST基因点突变检测 | 第35-36页 |
| 3.4 讨论 | 第36-39页 |
| 第4章 胞质显微注射Cas9/sgRNA后猪SST基因的删除检测 | 第39-53页 |
| 4.1 材料试剂 | 第39-40页 |
| 4.1.1 主要的仪器及耗材 | 第39页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第39页 |
| 4.1.3 主要溶液配制 | 第39-40页 |
| 4.2 试验方法 | 第40-46页 |
| 4.2.1 sgRNA、Cas9 mRNA的准备 | 第40-42页 |
| 4.2.2 卵母细胞的采集和体外成熟培养 | 第42-43页 |
| 4.2.3 RNA胞质显微注射猪卵母细胞及RNA最佳注射浓度的选择 | 第43-44页 |
| 4.2.4 猪卵母细胞孤雌激活 | 第44-45页 |
| 4.2.5 PCR删除效率的检测 | 第45-46页 |
| 4.2.6 DNA测序分析 | 第46页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第46-51页 |
| 4.3.1 pDR274-sgRNA质粒测序结果 | 第46-47页 |
| 4.3.2 sgRNA和Cas9 mRNA体外转录结果 | 第47-48页 |
| 4.3.3 RNA显微注射对孤雌胚体外发育潜力的影响 | 第48页 |
| 4.3.4 RNA胞质显微注射删除效率的定量检测结果分析 | 第48-50页 |
| 4.3.5 DNA测序结果分析 | 第50-51页 |
| 4.4 讨论 | 第51-53页 |
| 结论 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-63页 |
| 致谢 | 第63-65页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第65页 |
