农药污染土壤中漆酶基因的高通量筛选与克隆
| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 英文缩略表 | 第4-9页 |
| 第一章 前言 | 第9-20页 |
| ·微生物漆酶在自然界中的分布和生理功能 | 第9-10页 |
| ·微生物漆酶的结构特征和催化机制 | 第10-12页 |
| ·漆酶的蛋白序列 | 第10页 |
| ·蛋白的三级结构 | 第10-11页 |
| ·漆酶的结构特征 | 第11页 |
| ·漆酶的催化机制 | 第11-12页 |
| ·漆酶的催化底物 | 第12-13页 |
| ·微生物漆酶活性的影响因素 | 第13-14页 |
| ·pH值 | 第13页 |
| ·温度 | 第13-14页 |
| ·金属离子 | 第14页 |
| ·微生物漆酶基因的克隆 | 第14-15页 |
| ·漆酶基因的重组表达 | 第15-16页 |
| ·微生物漆酶的工业化应用前景 | 第16-18页 |
| ·环境保护 | 第16-17页 |
| ·造纸工业 | 第17页 |
| ·其它领域 | 第17-18页 |
| ·本章主要研究目的及意义 | 第18-20页 |
| ·研究目的 | 第18页 |
| ·研究意义 | 第18-19页 |
| ·实验设计方案 | 第19-20页 |
| 第二章 农药污染土壤漆酶多样性分析 | 第20-25页 |
| ·试验材料 | 第20页 |
| ·试验材料 | 第20页 |
| ·主要溶液 | 第20页 |
| ·工具酶、试剂 | 第20页 |
| ·试验方法 | 第20-23页 |
| ·兼并引物的设计 | 第20页 |
| ·土壤DNA的提取 | 第20-21页 |
| ·PCR检测漆酶保守区小片段 | 第21-23页 |
| ·实验结果与分析 | 第23页 |
| ·测序克隆子的多样性数据分析 | 第23页 |
| ·多样性系统树的建立 | 第23页 |
| ·讨论 | 第23页 |
| ·本章小结 | 第23-25页 |
| 第三章 土壤宏基因组Fosmid文库的建立 | 第25-36页 |
| ·试验材料 | 第25-26页 |
| ·试验材料 | 第25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·工具酶、试剂及试剂盒 | 第25页 |
| ·实验菌株和质粒 | 第25-26页 |
| ·溶液配制 | 第26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·试验方法 | 第26-33页 |
| ·DNA操作方法 | 第26页 |
| ·土壤基因组的提取 | 第26-29页 |
| ·eDNA的提取 | 第26-27页 |
| ·eDNA的纯化 | 第27-28页 |
| ·eDNA的浓缩 | 第28-29页 |
| ·基因组Fosmid文库的构建 | 第29-32页 |
| ·前期准备性工作 | 第29页 |
| ·插入DNA的切割 | 第29页 |
| ·插入DNA的平末端补齐 | 第29页 |
| ·对末端补平的DNA进行大小的选择 | 第29-30页 |
| ·对胶块中的DNA进行回收 | 第30页 |
| ·连接反应 | 第30-31页 |
| ·对DNA进行包装 | 第31页 |
| ·注意事项 | 第31-32页 |
| ·基因组Fosmid文库质量的评价 | 第32页 |
| ·基因组Fosmid文库的保存 | 第32-33页 |
| ·实验结果与分析 | 第33-35页 |
| ·土壤宏基因组的提取 | 第33页 |
| ·基因组Fosmid文库的构建 | 第33-34页 |
| ·基因组Fosmid文库的质量评价 | 第34-35页 |
| ·讨论 | 第35页 |
| ·本章小结 | 第35-36页 |
| 第四章 Fosmid文库中漆酶的筛选 | 第36-41页 |
| ·实验材料 | 第36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·工具酶，引物，试剂及试剂盒 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-37页 |
| ·实验结果与分析 | 第37-38页 |
| ·基因组文库中阳性克隆子的命名 | 第37-38页 |
| ·基因组文库阳性克隆子的筛选汇总 | 第38页 |
| ·讨论 | 第38页 |
| ·本章小结 | 第38-41页 |
| 第五章 漆酶Lac13H9的克隆及酶学性质分析 | 第41-53页 |
| ·实验材料 | 第41页 |
| ·主要仪器 | 第41页 |
| ·工具酶，试剂及试剂盒 | 第41页 |
| ·试验方法 | 第41-45页 |
| ·土壤宏基因组中筛选漆酶基因 | 第41-42页 |
| ·漆酶基因的克隆 | 第42页 |
| ·漆酶大肠杆菌重组表达质粒的构建 | 第42-43页 |
| ·重组漆酶 13H9的诱导发酵 | 第43页 |
| ·微好氧诱导发酵培养法[62] | 第43页 |
| ·低温诱导发酵培养法 | 第43页 |
| ·重组漆酶的纯化 | 第43-44页 |
| ·重组漆酶酶活测定及酶学性质分析 | 第44-45页 |
| ·重组漆酶最适温度和最适pH测定 | 第44页 |
| ·重组漆酶温度温度稳定性和pH稳定性测定 | 第44页 |
| ·不同金属离子和化学试剂对重组漆酶酶活力的影响 | 第44-45页 |
| ·Km和Kcat测定 | 第45页 |
| ·结果与分析 | 第45-50页 |
| ·漆酶基因的克隆及表达载体的构建 | 第45页 |
| ·漆酶基因的克隆 | 第45-47页 |
| ·重组漆酶 13H9sd在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第47-48页 |
| ·低温发酵 | 第47-48页 |
| ·微好氧发酵 | 第48页 |
| ·重组漆酶酶学性质的测定 | 第48-50页 |
| ·最适温度和温度稳定性 | 第48-49页 |
| ·最适pH和pH稳定性测定 | 第49页 |
| ·化学试剂和不同金属离子的耐受性 | 第49页 |
| ·Fe2+对漆酶Lac13H9的影响 | 第49-50页 |
| ·酶动力学参数 | 第50页 |
| ·讨论 | 第50-52页 |
| ·本章小结 | 第52-53页 |
| 第六章 结论 | 第53-56页 |
| 第七章 展望 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 作者简介 | 第63-64页 |
