| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-13页 |
| 英文缩写词表 | 第13-14页 |
| 目录 | 第14-19页 |
| 第一部分 引言 | 第19-42页 |
| 一、哺乳动物神经干细胞 | 第20-23页 |
| (一) 神经干细胞的特性与定义 | 第20-21页 |
| (二) 神经干细胞的应用价值 | 第21-22页 |
| (三) 神经干细胞的来源 | 第22-23页 |
| 二、低氧的生理意义及对神经干细胞发育的影响 | 第23-25页 |
| (一) 低氧是胚胎发育和成年脑组织的生理环境 | 第23页 |
| (二) 低氧对神经干细胞增殖和分化的影响 | 第23-25页 |
| 三、HIF-1途径—低氧调控神经干细胞发育的核心信号通路 | 第25-30页 |
| (一) HIF-1的发现 | 第25页 |
| (二) HIF-1的功能结构 | 第25-26页 |
| (三) 氧依赖的HIF-1调控 | 第26-29页 |
| (四) 非氧依赖的HIF-1调控 | 第29页 |
| (五) HIF-1的靶基因与细胞存活 | 第29-30页 |
| (六) HIF-1在神经干细胞发育中的作用 | 第30页 |
| 四、microRNAs—低氧调控神经干细胞发育的新发现 | 第30-39页 |
| (一) miRNAs的发现与命名 | 第30-31页 |
| (二) miRNAs的特点 | 第31-33页 |
| (三) miRNAs的加工机制与功能 | 第33-35页 |
| (四) DNA甲基化对miRNAs的表达调控 | 第35-36页 |
| (五) miRNAs与神经系统 | 第36-38页 |
| (六) 低氧对miRNAs表达调控的影响 | 第38-39页 |
| 五、本研究的目的与意义 | 第39-42页 |
| 第二部分 神经干细胞的分离培养和鉴定以及低氧时NSCs中HIF-1稳定的调控机制 | 第42-69页 |
| 一、实验材料与试剂 | 第42-46页 |
| (一) 主要仪器 | 第42-43页 |
| (二) 实验动物 | 第43页 |
| (三) 抗体 | 第43-44页 |
| (四) 主要试剂及常用试剂配方 | 第44-46页 |
| 二、实验方法 | 第46-56页 |
| (一) 低氧条件与分组 | 第46-47页 |
| (二) 原代大鼠中脑神经干细胞的分离 | 第47页 |
| (三) 神经干细胞的传代培养 | 第47-48页 |
| (四) 体外培养神经干细胞自我更新与分化能力的免疫荧光鉴定 | 第48-49页 |
| (五) 细胞中总RNA的提取及反转录PCR检测mRNA表达水平的变化 | 第49-52页 |
| (六) 细胞中蛋白的提取及Western blot检测蛋白表达水平的变化 | 第52-55页 |
| (七) 流式细胞术检测细胞周期与增殖指数(PI) | 第55页 |
| (八) 细胞存活率分析 | 第55页 |
| (九) 数据处理与统计学分析 | 第55-56页 |
| 三、实验结果 | 第56-65页 |
| (一) 原代大鼠中脑神经干细胞的分离培养与鉴定结果 | 第56-57页 |
| (二) 低氧对体外培养NSCs中HIF-1α和HSP90表达的影响 | 第57-59页 |
| (三) 抑制HSP90活性对低氧诱导的HIF-1α蛋白稳定的影响 | 第59-61页 |
| (四) 抑制HSP90活性对神经干细胞存活的影响 | 第61-63页 |
| 1. 用GA抑制HSP90活性对NSCs存活的影响 | 第61-62页 |
| 2. 用赤根霉素(Radicicol)抑制HSP90活性对HIF-1α稳定和NSCs存活的影响 | 第62-63页 |
| (五) 抑制HSP90活性对神经干细胞增殖及细胞周期的影响 | 第63-64页 |
| (六) 抑制HSP90活性后对HIF-1靶基因表达的影响 | 第64-65页 |
| 四、讨论 | 第65-68页 |
| 五、结论 | 第68-69页 |
| 第三部分 低氧下神经干细胞中表达变化的microRNAs的芯片筛选及表达验证 | 第69-81页 |
| 一、实验材料与试剂 | 第69-70页 |
| (一) 主要仪器 | 第69页 |
| (二) 主要试剂及常用试剂配方 | 第69-70页 |
| 二、实验方法 | 第70-74页 |
| (一) RNA提取与ncRNAs表达谱分析 | 第70页 |
| (二) Real-Time PCR检测miRNAs表达 | 第70-73页 |
| (三) 生物信息学分析 | 第73-74页 |
| (四) 数据处理与统计学分析 | 第74页 |
| 三、实验结果 | 第74-78页 |
| (一) 低氧下NSCs中表达变化的ncRNAs的芯片筛选结果 | 第74页 |
| (二) Q-PCR验证低氧下表达上调的miRNAs | 第74-76页 |
| (三) 生物信息学分析可能受HIF-1调控的miRNAs | 第76-77页 |
| (四) 不同氧浓度对NSCs中miR-210的表达影响 | 第77-78页 |
| 四、讨论 | 第78-80页 |
| 五、结论 | 第80-81页 |
| 第四部分 低氧时神经干细胞中miR-210表达调控机制的研究 | 第81-121页 |
| 一、实验材料与试剂 | 第81-82页 |
| (一)主要仪器 | 第81页 |
| (二) 实验动物、菌株与质粒 | 第81页 |
| (三) 抗体 | 第81页 |
| (四) 主要试剂及常用试剂配方 | 第81-82页 |
| 二、实验方法 | 第82-101页 |
| (一) pGL3-miRNA荧光素酶报告质粒的构建 | 第82-87页 |
| (二) pEGFP-HIF-1过表达质粒的构建、鉴定与表达验证 | 第87-89页 |
| (三) 双荧光素酶检测系统检测低氧及HIF-1对miRNAs的表达调控 | 第89-92页 |
| (四) 染色质免疫沉淀分析(ChIP) | 第92-93页 |
| (五) miR-210调控序列CpG岛分布的软件分析 | 第93页 |
| (六) 亚硫酸氢盐修饰测序法检测基因组DNA甲基化状态 | 第93-97页 |
| (七) Real-Time PCR检测AZA对NSCs中miRNAs表达的影响 | 第97页 |
| (八) Real-Time PCR检测NSCs中Dnmts家族的表达水平 | 第97-98页 |
| (九) NSCs中Dnmts及HAT酶活性检测 | 第98-100页 |
| (十) 数据处理与统计学分析 | 第100-101页 |
| 三、实验结果 | 第101-115页 |
| (一) HIF-1途径对miR-210表达的调控 | 第101-104页 |
| 1. pGL3-miRNA荧光素酶质粒和pEGFP-HIF-1质粒的构建及鉴定 | 第101-102页 |
| 2. 双荧光素酶系统检测过表达HIF-1对pGL3-miRNA荧光素酶活性的影响 | 第102-104页 |
| 3. ChIP检测与HIF-1蛋白结合的miRNA调控序列 | 第104页 |
| (二) DNA甲基化对miR-210表达的调控 | 第104-115页 |
| 1. 软件分析miR-210调控序列的CpG岛分布 | 第105页 |
| 2. AZA抑制DNA甲基化对miR-210表达的影响 | 第105-108页 |
| 3. 亚硫酸盐修饰测序法检测低氧下miR-210调控序列甲基化修饰水平的变化 | 第108-112页 |
| 4. 低氧对神经干细胞中Dnmts表达水平的影响 | 第112-113页 |
| 5. 低氧对神经干细胞中Dnmts和HAT活性的影响 | 第113-115页 |
| 四、讨论 | 第115-120页 |
| 五、结论 | 第120-121页 |
| 第五部分 miR-210在神经干细胞及组织发育中的功能研究 | 第121-133页 |
| 一、实验材料与试剂 | 第121页 |
| (一) 主要仪器 | 第121页 |
| (二) 实验动物 | 第121页 |
| (三) 主要试剂及常用试剂配方 | 第121页 |
| 二、实验方法 | 第121-126页 |
| (一) miR-210慢病毒载体表达效果检测 | 第121-122页 |
| (二) CCK-8检测细胞的存活率 | 第122-123页 |
| (三) BrdU掺入及DAB染色检测细胞的增殖率 | 第123-124页 |
| (四) E16大鼠子宫胚胎电转及免疫组化检测 | 第124-126页 |
| 三、实验结果 | 第126-130页 |
| (一) miR-210慢病毒载体的过表达效果检测 | 第126页 |
| (二) CCK-8法检测过表达miR-210对细胞存活率的影响 | 第126-127页 |
| (三) BrdU掺入法检测过表达miR-210对细胞存活率的影响 | 第127-128页 |
| (四) 抑制miR-210对胎鼠神经发育的影响 | 第128-130页 |
| 四、讨论 | 第130-132页 |
| 五、结论 | 第132-133页 |
| 总结 | 第133-134页 |
| 论文创新点 | 第134-135页 |
| 参考文献 | 第135-146页 |
| 博士期间发表及待发表论文 | 第146-147页 |
| 致谢 | 第147-148页 |
