| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 1 前言 | 第13-21页 |
| ·番木瓜的生产和种植 | 第13-14页 |
| ·番木瓜的经济价值和开发前景 | 第13页 |
| ·番木瓜种植业面临的挑战和抗病品种改良的重要性 | 第13-14页 |
| ·番木瓜环斑病毒简介 | 第14-16页 |
| ·PRSV的形态特征 | 第14-15页 |
| ·PRSV在番木瓜上引起的症状 | 第15页 |
| ·PRSV的传播途径,株系以及寄住范围 | 第15-16页 |
| ·PRSV的基因组结构以及所编码的蛋白质 | 第16页 |
| ·植物病毒蛋白与宿主蛋白间互作的重要性 | 第16-18页 |
| ·NIa-Pro基因的研究现状 | 第18-19页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第19-20页 |
| ·技术路线 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-52页 |
| ·实验中所用到的主要材料、试剂、菌株及仪器等 | 第21-30页 |
| ·植物和病毒材料 | 第21页 |
| ·试剂 | 第21-22页 |
| ·菌株 | 第22页 |
| ·载体 | 第22-26页 |
| ·SRS酵母双杂交系统载体 | 第22-24页 |
| ·BIFC系统载体 | 第24-25页 |
| ·亚细胞定位载体 | 第25页 |
| ·原核表达载体 | 第25-26页 |
| ·引物 | 第26-29页 |
| ·仪器 | 第29-30页 |
| ·方法 | 第30-52页 |
| ·SRS系统筛选NIa-Pro互作宿主因子 | 第30-39页 |
| ·NIa-Pro诱饵载体的构建 | 第30-34页 |
| ·PRSV-HN接种 | 第30页 |
| ·番木瓜叶片总RNA提取 | 第30-31页 |
| ·NIa-Pro基因的克隆 | 第31页 |
| ·PCR产物回收 | 第31-32页 |
| ·PCR回收片段连接pMD18-T Vector | 第32页 |
| ·连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第32页 |
| ·菌液PCR检测 | 第32页 |
| ·生工法小量质粒提取 | 第32-33页 |
| ·克隆载体pMD18-T-NP和酵母表达载体pSos双酶切 | 第33页 |
| ·pSos-NP诱饵载体的构建和鉴定 | 第33-34页 |
| ·酵母菌株的表型鉴定和感受态制备 | 第34-35页 |
| ·酵母菌株的活化和表型鉴定 | 第34页 |
| ·cdc25H(α)感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·诱饵蛋白自激活检测 | 第35-36页 |
| ·NIa-Pro互作寄主因子初次筛选 | 第36-37页 |
| ·MACHEREY-NAGEL法提取文库质粒和诱饵载体质粒 | 第36页 |
| ·番木瓜cDNA文库筛选 | 第36-37页 |
| ·候选阳性转化子文库载体的分离和SRS回转验证 | 第37-39页 |
| ·天根法提取酵母质粒的提取 | 第37页 |
| ·酵母质粒的转化分离 | 第37-38页 |
| ·候选阳性转化子质粒PCR检测和质粒提取 | 第38页 |
| ·候选阳性克隆的回转 | 第38-39页 |
| ·SRS系统检测全长宿主因子与NIa-Pro的互作 | 第39-40页 |
| ·阳性克隆分析和全长宿主因子克隆的获得 | 第39页 |
| ·全长宿主因子pMyr载体构建 | 第39页 |
| ·SRS系统检测 | 第39-40页 |
| ·BIFC系统检测全长宿主因子与NIa-Pro的互作 | 第40-42页 |
| ·全长宿主因子BIFC载体构建 | 第40页 |
| ·BIFC分析 | 第40-42页 |
| ·微载体制备 | 第40-41页 |
| ·基因枪轰击转化洋葱表皮细胞与荧光观察 | 第41-42页 |
| ·BIFC分析NIa-Pro与PaFBPA1和NIa-Pro与PaMsrB1互作的亚细胞定位 | 第42-43页 |
| ·用于亚细胞定位的NIa-Pro、PaFBPA1和PaMsrB1载体构建 | 第42页 |
| ·BIFC分析NIa-Pro与PaFBPA1和NIa-Pro与PaMsrB1互作的亚细胞定位 | 第42-43页 |
| ·番木瓜叶片原生质体细胞的分离 | 第42页 |
| ·原生质转化与激光共聚焦显微镜观察 | 第42-43页 |
| ·SRS分析NIa-Pro,PaMsrB1和PaFBPA1不同突变体的互作 | 第43-46页 |
| ·各种突变体克隆的获得 | 第43页 |
| ·各种突变体载体构建 | 第43-44页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro不同缺失突变体与全长宿主因子PaMsrB1和PaFBPA1的互作 | 第44-45页 |
| ·SRS系统检测全长NIa-Pro与宿主因子PaMsrB1和PaFBPA1的不同缺失突变体的互作 | 第45页 |
| ·SRS系统检测全长NIa-Pro与宿主因子PaMsrB1和PaFBPA1的不同点突变体的互作 | 第45-46页 |
| ·原核表达NIa-Pro、PaFBPA1和PaMsrB1以及检测NIa-Pro对PaFBPA1和PaMsrB1的酶切 | 第46-49页 |
| ·原核表达载体构建与鉴定 | 第46-47页 |
| ·重组质粒的转化和表达 | 第47页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) | 第47页 |
| ·阳性克隆的诱导表达 | 第47页 |
| ·GST融合蛋白的纯化 | 第47-48页 |
| ·酶切分析 | 第48页 |
| ·Western blot分析酶切结果 | 第48-49页 |
| ·互作宿主因子PaFBPA1和PaMsrB1在PRSV入侵过程中的表达分析 | 第49-51页 |
| ·PRSV接种 | 第49页 |
| ·番木瓜叶片总RNA提取 | 第49页 |
| ·实时定量检测 | 第49-51页 |
| ·定量模板cDNA第一链合成 | 第49-50页 |
| ·实时定量检测 | 第50页 |
| ·结果分析 | 第50-51页 |
| ·病毒入侵过程中的活性氧表达分析 | 第51-52页 |
| ·样品制备 | 第51页 |
| ·Quantikine ELISA检测 | 第51-52页 |
| 3 结果 | 第52-84页 |
| ·SRS筛选NIa-Pro互作宿主因子 | 第52-55页 |
| ·NIa-Pro诱饵载体的构建和SRS系统自激活检测 | 第52-53页 |
| ·全长NIa-Pro的获得和诱饵载体构建 | 第52页 |
| ·酵母菌株cdc25H(α)感受态制备转化效率检测 | 第52-53页 |
| ·SRS系统自激活检测 | 第53页 |
| ·NIa-Pro互作因子初次筛选 | 第53-54页 |
| ·回转验证 | 第54-55页 |
| ·SRS系统检测6种全长宿主因子与NIa-Pro的互作 | 第55-62页 |
| ·6种宿主基因序列分析和全长克隆的获得 | 第55-60页 |
| ·全长宿主因子pMyr载体构建 | 第60-61页 |
| ·SRS系统检测结果分析 | 第61-62页 |
| ·BIFC系统检测6个宿主因子与NIa-Pro的互作 | 第62-64页 |
| ·6个宿主因子和NIa-Pro BIFC载体构建 | 第62-63页 |
| ·BIFC结果分析 | 第63-64页 |
| ·NIa-Pro-PaFBPA1和NIa-Pro-PaMsrB1的亚细胞定位 | 第64-67页 |
| ·NIa-Pro,PaFBPA1和PaMsrB1的亚细胞载体构建 | 第64-65页 |
| ·激光共聚焦显微镜观察分析 | 第65-67页 |
| ·SRS分析NIa-Pro,PaMsrB1和PaFBPA1不同突变体的互作 | 第67-77页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro不同缺失突变体与全长宿主因子PaMsrB1和PaFBPA1的互作 | 第67-70页 |
| ·PRSV NIa-Pro的生物信息学分析和缺失突变体设计 | 第67-68页 |
| ·缺失突变载体构建 | 第68-69页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro不同缺失突变体与全长宿主因子PaMsrBl 和 PaFBPAl 的互作 | 第69-70页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与全长宿主因子PaFBPA1不同缺失突变体的互作 | 第70-72页 |
| ·PaFBPA1的生物信息学分析和缺失突变体设计 | 第70页 |
| ·PaFBPA1缺失突变载体构建 | 第70-71页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与PaFBPA1缺失突变体的互作 | 第71-72页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与全长宿主因子PaFBPA1不同点突变体的互作 | 第72-73页 |
| ·PaFBPA1的生物信息学分析和点突变设计 | 第72页 |
| ·PaFBPA1点突变载体构建 | 第72页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与PaFBPA1点突变体的互作 | 第72-73页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与全长宿主因子PaMsrB1不同缺失突变体的互作 | 第73-75页 |
| ·PaMsrB1的生物信息学分析和缺失突变载体构建 | 第73-74页 |
| ·PaMsrB1缺失突变载体构建 | 第74页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与PaMsrB1缺失突变体的互作 | 第74-75页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与全长宿主因子PaMsrB1不同点突变体的互作 | 第75-77页 |
| ·PaMsrB1的生物信息学分析和点突变设计 | 第75-76页 |
| ·PaMsrB1点突变载体构建 | 第76页 |
| ·SRS系统检测NIa-Pro与PaMsrB1点突变体的互作 | 第76-77页 |
| ·原核表达NIa-Pro、PaFBPA1和PaMsrB1以及检测NIa-Pro对PaFBPA1和PaMsrB1的酶切 | 第77-80页 |
| ·NIa-Pro蛋白酶识别位点在PaFBPA1上的查找和分析 | 第77-78页 |
| ·NIa-Pro、PaFBPA1和PaMsrB1原核表达载体构建 | 第78-79页 |
| ·NIa-Pro、PaFBPA1和PaMsrB1大肠杆菌表达和纯化结果分析 | 第79页 |
| ·NIa-Pro对PaFBPA1和PaMsrB1的酶切分析 | 第79-80页 |
| ·互作宿主因子在PRSV入侵过程中的表达 | 第80-82页 |
| ·扩增曲线、融解曲线分析 | 第80-81页 |
| ·接种病毒后PaFBPA1和PaMSRB1的相对表达分析 | 第81-82页 |
| ·病毒入侵过程中的活性氧表达分析 | 第82-84页 |
| ·标准曲线绘制 | 第82-83页 |
| ·PRSV接种不同时间ROS变化结果 | 第83-84页 |
| 4 讨论 | 第84-89页 |
| ·NIa-Pro互作宿主因子的分析 | 第84-89页 |
| ·NIa-Pro与PaFBPA1互作分析 | 第84-85页 |
| ·NIa-Pro与PaMsrB1互作分析 | 第85-87页 |
| ·NIa-Pro与PaEIF3G、PaMTL、PaFK506BP和PaGTPBP互作分析 | 第87-89页 |
| 5 结论 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-97页 |
| 致谢 | 第97页 |
