| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-10页 |
| 一、引言 | 第10-20页 |
| 1 番木瓜花叶病毒 | 第10-11页 |
| ·PaMV基因组结构与功能 | 第10-11页 |
| ·PaMV的传播途径及在番木瓜上引起的症状 | 第11页 |
| 2 病毒诱导的基因沉默 | 第11-16页 |
| ·VIGS的概述 | 第11-12页 |
| ·VIGS的沉默机理 | 第12-13页 |
| ·siRNA介导的VIGS机理 | 第12页 |
| ·人工miRNA基因沉默的机理 | 第12-13页 |
| ·VIGS的发展 | 第13-15页 |
| ·VIGS的优势 | 第15-16页 |
| ·VIGS的缺点 | 第16页 |
| ·VIGS的展望 | 第16页 |
| 3 番木瓜基因组学研究 | 第16-18页 |
| ·番木瓜基因组计划 | 第16-17页 |
| ·番木瓜后基因组学的研究 | 第17页 |
| ·番木瓜基因组学研究展望 | 第17-18页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 5 技术路线 | 第19-20页 |
| 二、材料与方法 | 第20-39页 |
| 1 材料 | 第20-25页 |
| ·植物材料和病毒株 | 第20页 |
| ·菌株 | 第20页 |
| ·实验仪器 | 第20页 |
| ·主要试剂 | 第20-21页 |
| ·载体及图谱 | 第21-23页 |
| ·主要试剂配制 | 第23-24页 |
| ·引物 | 第24-25页 |
| 2 方法 | 第25-39页 |
| ·PaMV全长cDNA的扩增 | 第25-30页 |
| ·感病叶片总RNA的提取 | 第25-26页 |
| ·病毒cDNA第一链的合成 | 第26-27页 |
| ·反转录反应体系 | 第26-27页 |
| ·反转录反应条件 | 第27页 |
| ·病毒CP基因的扩增与检测 | 第27-29页 |
| ·病毒CP基因的扩增 | 第27页 |
| ·病毒CP基因片段的回收 | 第27-28页 |
| ·CP基因PCR产物与T载体连接 | 第28页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第28页 |
| ·序列测定和生物信息学分析 | 第28-29页 |
| ·病毒全长cDNA的扩增与检测 | 第29-30页 |
| ·病毒全长cDNA的扩增 | 第29页 |
| ·病毒全长cDNA的连接与转化 | 第29页 |
| ·PaMV-HN cDNA序列测定和生物信息学分析 | 第29-30页 |
| ·菌液保存与质粒提取 | 第30页 |
| ·PaMV-HN全长cDNA侵染性克隆的构建 | 第30-35页 |
| ·载体的构建 | 第30-33页 |
| ·病毒表达载体的构建 | 第30-32页 |
| ·PaMV-HN全长片段的PCR扩增 | 第30-31页 |
| ·PaMV-HN扩增片段与中间载体的连接 | 第31页 |
| ·PaMV-HN与pGreenII0000载体的连接 | 第31-32页 |
| ·体外转录载体的构建 | 第32-33页 |
| ·PaMV-HN全长eDNA与pGEM(?)-T Easy Vector改造 | 第32-33页 |
| ·In-Fusion~(TM)Advantage PCR Cloning Kits连接 | 第33页 |
| ·连接产物的转化与检测 | 第33页 |
| ·接种植物 | 第33-35页 |
| ·农杆菌接种法 | 第33-34页 |
| ·农杆菌转化 | 第33-34页 |
| ·植株接种 | 第34页 |
| ·体外转录接种法 | 第34-35页 |
| ·体外转录 | 第34-35页 |
| ·摩擦接种 | 第35页 |
| ·病叶检测 | 第35页 |
| ·PaMV-HN诱导的基因沉默载体的构建 | 第35-39页 |
| ·载体设计 | 第35-36页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第36页 |
| ·套叠PCR | 第36页 |
| ·目的片段PDS的扩增 | 第36页 |
| ·PaMV-HN VIGS载体与中间载体的连接转化 | 第36-37页 |
| ·与pGreenII0000载体的连接转化 | 第37页 |
| ·OZ-LIC法构建沉默PDS基因的PaMV-HN VIGS载体 | 第37-38页 |
| ·T_4-DNA聚合酶处理PCR产物 | 第37-38页 |
| ·载体质粒的处理 | 第38页 |
| ·连接转化 | 第38页 |
| ·农杆菌转化与接种 | 第38-39页 |
| 三、结果 | 第39-50页 |
| 1. PaMV病叶总RNA的电泳检测 | 第39页 |
| 2. PaMV CP-HN基因的扩增检测 | 第39-40页 |
| 3. PaMV全长cDNA的克隆与测序 | 第40-41页 |
| 4. PaMV-HN全长cDNA侵染性克隆的构建 | 第41-43页 |
| ·病毒表达载体的构建 | 第41-42页 |
| ·体外转录载体的构建 | 第42-43页 |
| 5. PaMV-HN-3和PaMV-HN-4的侵染性分析 | 第43-45页 |
| ·PaMV-HN-3和PaMV-HN-4的接种与症状表现 | 第43-44页 |
| ·PaMV-HN-3和PaMV-HN-4的侵染性分析的RT-PCR检测 | 第44-45页 |
| 6. PaMV-HN VIGS载体的构建 | 第45-48页 |
| ·PaMV-VIGS-1的构建 | 第45-47页 |
| ·PaMV-VIGS-3的构建 | 第47-48页 |
| 7. PaMV-VIGS-3诱导PDS基因沉默的分析 | 第48-50页 |
| ·PaMV-VIGS-3的接种与症状表现 | 第48-50页 |
| ·PDS基因沉默的分子水平分析 | 第50页 |
| 四、讨论 | 第50-55页 |
| 1. PaMV-HN全长cDNA的扩增 | 第50-51页 |
| 2. PaMV-HN侵染性克隆的构建 | 第51页 |
| 3. PaMV-HN VIGS侵染性克隆的构建 | 第51-52页 |
| 4. PaMV-HN全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 | 第52-53页 |
| 5. PaMV-HN VIGS侵染性克隆的侵染性分析 | 第53-55页 |
| 五、结论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
